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protéine recombinantes Flashcards

1
Q

qu’est ce qu’utilise les vecteurs d’expression type pET

A

= utilise une RNA polymérase T7
- promoteur T7 fort = ajout séquence inductible via IPTG
- gène lysosome = inhibiteur de la T7 pour réguler l’induction

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Q

à quoi ça sert d’augmenter la production de répresseur

A
  • en absence d’inducteur de l’opéron = pas du tout de transcription car bcp de répresseur
  • en présence d’inducteur = transcription
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3
Q

quels sont les 2 types de plasmide selon leur réplication chez la levure

A
  • plasmide réplicatif = réplique tout seul via une Ori
  • plasmide intégratif = réplique par recombinaison homologue dans le chr de la levure
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4
Q

c’est quoi la chromato IMAC ? elution

A

= immobilized metal affinity chromato, où la phase statio est du Nickel
- pas besoin d’être en condition native
- élution = imidazole qui remplace l’His car cycle de l’His

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5
Q

à quoi ça sert les protéines chaperons

A

= permettre aux protéines de prendre leur conformation native
- DnaK-DnaJ, GroEL-GroES

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6
Q

quelles séquences sont présente sur le vecteur recombinant

A
  • terminateur de transcription
  • traduction = séquence kozak, codon stop
  • peptide signal
  • origine de réplication levure = 2 microns
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7
Q

comment on fait pour transfecter des levures

A
  • électroporation
  • choc thermique = traité avec de l’acétate de sodium pour aider à rentrer
  • protoplasme = levure sans paroi après traitement enzymatique lyticase
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8
Q

c’est quoi la double crossing over

A

= gène AOXI qui permet la croissance sur méthanol
- recombinaison homologue de ce gène qui permet la sélection

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9
Q

quelle proportion peut représenter les protéines recmobinantes

A

30% des protéines de la cellule

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10
Q

c’est quoi les codons rare

A

= les bactéries ont moins de codons que les cellules eucaryotes, donc certains codons ne sont pas dispo et peuvent bloquer la traduction

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11
Q

c’est quoi le simple crossing-over

A

= la souche possède une mutation sur un gène pour brique élémentaire qui la rends auxotrophe
- recombinaison homologue qui se place dans le gène et le rends inactif et le remplace pour rendre la souche proto

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12
Q

pourquoi on doit réguler le nombre de copie des vecteurs

A

= trop de copies de la protéine peut la rendre insoluble
- 15 à 60 copies par cellules est bin

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13
Q

de quoi dépend la stratégie d’expression

A
  • choix de l’hôte (cellule) et du vecteur (transgène dans un plasmide)
  • dépend des objectifs et des propriétés de la protéine à exprimer
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14
Q

sur quelle souches de bactéries est utilisé le vecteur pET

A

= souche avec gène RNA polymérase T7 dans leur chromosome

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15
Q

ainsi comment fonctionne le vecteur pET

A

= en présence d’IPTG, transcription de la RNA polymérase T7 pour sera utilisé seulement pour le promoteur du vecteur d’expression et pas pour le génome

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16
Q

comment on utilise un plasmide intégratif

A

= on le linéarise pour pouvoir l’intégrer
- simple crossingover = intégration
- double crossingover = remplace un gène

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17
Q

c’est quoi les avantages chez les levures

A
  • manip simples
  • croissance raipde
  • non pathogène
  • modification PT
  • production forte
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18
Q

inconv pour protéine cytoplaslmique soluble

A
  • pas de formation de pont disulfure car oxydant
  • protéine pas forcément soluble
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19
Q

quelles séquence a le vecteur d’expression en plus

A
  • MCS, gène résistance = vecteurs de base
  • promoteur fort et inductible = peut être activé/inactivé
  • terminateur transcription
  • séquences traduction = RBS, ATG et codon stop
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20
Q

comment on facilite la purification?

A

= surexprime la protéine pour avoir une qté plus importante à purifier après extraction

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21
Q

quels sont les objectifs en recherche fondamentale

A
  • étude fonctionnelle = relation strcuture fonction, activité biologique, étude structurale
  • outil = antigènes, enzyme de restriction
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22
Q

comment augmenter l’affinité du tag His

A

ajouter plus de His

23
Q

avantages pour les protéines solubles envoyés dans le périplasme

A
  • plus oxydant que le cytoplasme = formation de pont disulfures
  • protocole de purif plus simple = très peu de protéines donc plus qu’à lyser la mb externe avec choc osmo
24
Q

comment on sélectionne les levures recombinantes

A
  • antibiotique
  • milieu sélectif souvent
25
comment on sélectionne sur milieu sélectif
= souche defficiente pour une brique élémentaire qui ne pousse pas sur milieu minimum - on rajoute le gène de l’auxotrophie
26
quelles sont les différentes types de protéines pour le clonage
- soluble = situation la plus simple - associé à la membrane - transmembranaire = domaines hydrophobes, dur à cloner
27
protocole pour purif via GST
1. accrochage de la proteine de fusion sur colonne d'agarose 2. élutions avec glutathion réduit, pour élution par competition 3. endopeptidase après élution pour couper le tag 4. chromato pour séparer l’endopeptidase, le tag et protéine
28
comment on fait des protéines recombinantes chez les levures
1. construction chez Coli du vecteur recombinant 2. amplification puis extractions 3. si vecteur intégratif = linéarisation par enzyme restrcition 4. transformation levures compétentes 5. sélection puis verif via SDS-PAGE ou WB de l’expression
29
quelles peuvent être les stratégies d’expression
- protéine soluble envoyé dans le périplasme avec signal N-term - protéines cytoplasmique soluble - protéine cytoplasmique insoluble
30
inconv des protéines cyto insoluble
- protocole de solubilsation des corps inclusion = urée, détergents - protocole de renaturation = dialyse
31
inconv des protéines de fusion
- interférence avec le repliement ou activité biologique des fois - élimination du tag pas toujours total
32
pourquoi les modifcations PT sont à prendre en compte dans la stratégie
= les modif PT peuvent assurer la fonciton de la protéine et certains hôte n’en font pas
33
comment on peut contrer le pb des codons rare
- mutagénèse sur les codons rare - transformation bactérie via plasmide qui contient le gène des codons rare
34
comment est utilisé l’opéron lactose pour inductibilité (2)
- PlacUVS = inducteur lactose indépendant de CAP (inhibe opéron en présence de glucose) - Ptac = utilisation de l’IPTG pour mimic le lactose
35
c’est quoi la transfection
transformation pour les cellules eucaryotes
36
quels sont les hôtes possibles
- système acellulaire - bactéries, levures, champignons - cellules eucaryote en culture = utilisé eà 56% - animaux ou plantes transgéniques
37
c’est quoi les limites chez les levures
- production plus modestes chez S.cerevisiae - seules les mannosylations possibles - hyperglycosylation peut rendre la prot immunogénique et déclencher une réaction allergique
38
quels sont les signaux N-term pour que la prot soit envoyé
= signal N-term OmpA, phosphatase alcaline
39
inconv pour les protéines solubles envoyés dans le périplasme
- taux expression plus faible - formation corps inclusion car insoluble
40
comment induire la transcription chez Pichia pastoris
= promoteur AOXI inductible quand y’a du méthanol
41
si on veut une protéine de la voie de sécrétion on fait quoi
= on ajoute un peptide signal “facteur alpha” en Nterm pour l’envoyer dans la voie de sécrétion
42
quel type de souche utilise on comme hôte
- souche defficiente pour les protéases - souche ARNt rare intégrés dans le génome - souche permet les pont disulfure - souche permet des conditions de culture diff
43
pour les vecteur utilisés pour bactérie/levures quelles séquences doit on avoir
- 1 ori et 1 marqueur de sélection procaryote - 1 ori et 1 marqueur de sélection eucaryote
44
comment on peut enlever le tag pendant la purif
= endopeptidase qui coupe au niveau du MSC
45
comment fonctionnennt les tag polyHis (conditions chromato)
= séquence de 6 à 10 His aux extrémités - affinité pour les cations métaliques bivalents - pour chromato en condition native ou dénaturante (possible corps inclusion)
46
quels peuvent être les objectifs en médecine
- protéine thérapeutiques = production insuiine, hormones croissance, anticorps, interleukines.. - diagnostic = enzymes, anticorps
47
avantages pour prot cyto insolubles
- production accrue - pas de toxicité (pas dénaturée) - protection contre protéolyse - facile à purifier = corps inclusion
48
quelles sont les protéines de fusion courantes? (glu, mal, calmoduline)
- glutathion-S transférase = affinité pour glutathion qui s’accroche à l’agarose lors de la purif - maltose binding protein = affinité pour maltose pour purif sur amylose - calmoduline binding peptide = affinité pour calmoduline en présence de Ca2+
49
quels sont les bénéfices du clonage chez coli
- croissance rapide - desnité cell élevée - substrat bon marché - nombreux vecteurs dispo - nombreuses souches dispo - marquages possible
50
c’est quoi les inconvénients du clonage chez coli
- protéine devient insoluble ou toxique = à cause des conditions physio - protéolyse = protéase ou endopeptidase détruit car intuile - pas de modif PT - endotoxines = LPS
51
c’est quoi une protéine de fusion
= ajout d’un tag aux extrémités qui sera lu en même temps par la poly pour faciliter les étapes de purif
52
pourquoi il faut éliminer le tag ?
souvent très long et interfère avec les études
53
comment on peut faire pour couper le tag directement dans la colonne
= precission protease qui possède un domaine GTS pour couper, puis se fixe à la colonne
54
avantages des prot de fusion
- purif = chromato d’affinité - destination = peptide signal - facilite le repliement de la prot - marqueur d’expression = anticorps

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