protéine recombinantes Flashcards
qu’est ce qu’utilise les vecteurs d’expression type pET
= utilise une RNA polymérase T7
- promoteur T7 fort = ajout séquence inductible via IPTG
- gène lysosome = inhibiteur de la T7 pour réguler l’induction
à quoi ça sert d’augmenter la production de répresseur
- en absence d’inducteur de l’opéron = pas du tout de transcription car bcp de répresseur
- en présence d’inducteur = transcription
quels sont les 2 types de plasmide selon leur réplication chez la levure
- plasmide réplicatif = réplique tout seul via une Ori
- plasmide intégratif = réplique par recombinaison homologue dans le chr de la levure
c’est quoi la chromato IMAC ? elution
= immobilized metal affinity chromato, où la phase statio est du Nickel
- pas besoin d’être en condition native
- élution = imidazole qui remplace l’His car cycle de l’His
à quoi ça sert les protéines chaperons
= permettre aux protéines de prendre leur conformation native
- DnaK-DnaJ, GroEL-GroES
quelles séquences sont présente sur le vecteur recombinant
- terminateur de transcription
- traduction = séquence kozak, codon stop
- peptide signal
- origine de réplication levure = 2 microns
comment on fait pour transfecter des levures
- électroporation
- choc thermique = traité avec de l’acétate de sodium pour aider à rentrer
- protoplasme = levure sans paroi après traitement enzymatique lyticase
c’est quoi la double crossing over
= gène AOXI qui permet la croissance sur méthanol
- recombinaison homologue de ce gène qui permet la sélection
quelle proportion peut représenter les protéines recmobinantes
30% des protéines de la cellule
c’est quoi les codons rare
= les bactéries ont moins de codons que les cellules eucaryotes, donc certains codons ne sont pas dispo et peuvent bloquer la traduction
c’est quoi le simple crossing-over
= la souche possède une mutation sur un gène pour brique élémentaire qui la rends auxotrophe
- recombinaison homologue qui se place dans le gène et le rends inactif et le remplace pour rendre la souche proto
pourquoi on doit réguler le nombre de copie des vecteurs
= trop de copies de la protéine peut la rendre insoluble
- 15 à 60 copies par cellules est bin
de quoi dépend la stratégie d’expression
- choix de l’hôte (cellule) et du vecteur (transgène dans un plasmide)
- dépend des objectifs et des propriétés de la protéine à exprimer
sur quelle souches de bactéries est utilisé le vecteur pET
= souche avec gène RNA polymérase T7 dans leur chromosome
ainsi comment fonctionne le vecteur pET
= en présence d’IPTG, transcription de la RNA polymérase T7 pour sera utilisé seulement pour le promoteur du vecteur d’expression et pas pour le génome
comment on utilise un plasmide intégratif
= on le linéarise pour pouvoir l’intégrer
- simple crossingover = intégration
- double crossingover = remplace un gène
c’est quoi les avantages chez les levures
- manip simples
- croissance raipde
- non pathogène
- modification PT
- production forte
inconv pour protéine cytoplaslmique soluble
- pas de formation de pont disulfure car oxydant
- protéine pas forcément soluble
quelles séquence a le vecteur d’expression en plus
- MCS, gène résistance = vecteurs de base
- promoteur fort et inductible = peut être activé/inactivé
- terminateur transcription
- séquences traduction = RBS, ATG et codon stop
comment on facilite la purification?
= surexprime la protéine pour avoir une qté plus importante à purifier après extraction
quels sont les objectifs en recherche fondamentale
- étude fonctionnelle = relation strcuture fonction, activité biologique, étude structurale
- outil = antigènes, enzyme de restriction
comment augmenter l’affinité du tag His
ajouter plus de His
avantages pour les protéines solubles envoyés dans le périplasme
- plus oxydant que le cytoplasme = formation de pont disulfures
- protocole de purif plus simple = très peu de protéines donc plus qu’à lyser la mb externe avec choc osmo
comment on sélectionne les levures recombinantes
- antibiotique
- milieu sélectif souvent
comment on sélectionne sur milieu sélectif
= souche defficiente pour une brique élémentaire qui ne pousse pas sur milieu minimum
- on rajoute le gène de l’auxotrophie
quelles sont les différentes types de protéines pour le clonage
- soluble = situation la plus simple
- associé à la membrane
- transmembranaire = domaines hydrophobes, dur à cloner
protocole pour purif via GST
- accrochage de la proteine de fusion sur colonne d’agarose
- élutions avec glutathion réduit, pour élution par competition
- endopeptidase après élution pour couper le tag
- chromato pour séparer l’endopeptidase, le tag et protéine
comment on fait des protéines recombinantes chez les levures
- construction chez Coli du vecteur recombinant
- amplification puis extractions
- si vecteur intégratif = linéarisation par enzyme restrcition
- transformation levures compétentes
- sélection puis verif via SDS-PAGE ou WB de l’expression
quelles peuvent être les stratégies d’expression
- protéine soluble envoyé dans le périplasme avec signal N-term
- protéines cytoplasmique soluble
- protéine cytoplasmique insoluble
inconv des protéines cyto insoluble
- protocole de solubilsation des corps inclusion = urée, détergents
- protocole de renaturation = dialyse
inconv des protéines de fusion
- interférence avec le repliement ou activité biologique des fois
- élimination du tag pas toujours total
pourquoi les modifcations PT sont à prendre en compte dans la stratégie
= les modif PT peuvent assurer la fonciton de la protéine et certains hôte n’en font pas
comment on peut contrer le pb des codons rare
- mutagénèse sur les codons rare
- transformation bactérie via plasmide qui contient le gène des codons rare
comment est utilisé l’opéron lactose pour inductibilité (2)
- PlacUVS = inducteur lactose indépendant de CAP (inhibe opéron en présence de glucose)
- Ptac = utilisation de l’IPTG pour mimic le lactose
c’est quoi la transfection
transformation pour les cellules eucaryotes
quels sont les hôtes possibles
- système acellulaire
- bactéries, levures, champignons
- cellules eucaryote en culture = utilisé eà 56%
- animaux ou plantes transgéniques
c’est quoi les limites chez les levures
- production plus modestes chez S.cerevisiae
- seules les mannosylations possibles
- hyperglycosylation peut rendre la prot immunogénique et déclencher une réaction allergique
quels sont les signaux N-term pour que la prot soit envoyé
= signal N-term OmpA, phosphatase alcaline
inconv pour les protéines solubles envoyés dans le périplasme
- taux expression plus faible
- formation corps inclusion car insoluble
comment induire la transcription chez Pichia pastoris
= promoteur AOXI inductible quand y’a du méthanol
si on veut une protéine de la voie de sécrétion on fait quoi
= on ajoute un peptide signal “facteur alpha” en Nterm pour l’envoyer dans la voie de sécrétion
quel type de souche utilise on comme hôte
- souche defficiente pour les protéases
- souche ARNt rare intégrés dans le génome
- souche permet les pont disulfure
- souche permet des conditions de culture diff
pour les vecteur utilisés pour bactérie/levures quelles séquences doit on avoir
- 1 ori et 1 marqueur de sélection procaryote
- 1 ori et 1 marqueur de sélection eucaryote
comment on peut enlever le tag pendant la purif
= endopeptidase qui coupe au niveau du MSC
comment fonctionnennt les tag polyHis (conditions chromato)
= séquence de 6 à 10 His aux extrémités
- affinité pour les cations métaliques bivalents
- pour chromato en condition native ou dénaturante (possible corps inclusion)
quels peuvent être les objectifs en médecine
- protéine thérapeutiques = production insuiine, hormones croissance, anticorps, interleukines..
- diagnostic = enzymes, anticorps
avantages pour prot cyto insolubles
- production accrue
- pas de toxicité (pas dénaturée)
- protection contre protéolyse
- facile à purifier = corps inclusion
quelles sont les protéines de fusion courantes? (glu, mal, calmoduline)
- glutathion-S transférase = affinité pour glutathion qui s’accroche à l’agarose lors de la purif
- maltose binding protein = affinité pour maltose pour purif sur amylose
- calmoduline binding peptide = affinité pour calmoduline en présence de Ca2+
quels sont les bénéfices du clonage chez coli
- croissance rapide
- desnité cell élevée
- substrat bon marché
- nombreux vecteurs dispo
- nombreuses souches dispo
- marquages possible
c’est quoi les inconvénients du clonage chez coli
- protéine devient insoluble ou toxique = à cause des conditions physio
- protéolyse = protéase ou endopeptidase détruit car intuile
- pas de modif PT
- endotoxines = LPS
c’est quoi une protéine de fusion
= ajout d’un tag aux extrémités qui sera lu en même temps par la poly pour faciliter les étapes de purif
pourquoi il faut éliminer le tag ?
souvent très long et interfère avec les études
comment on peut faire pour couper le tag directement dans la colonne
= precission protease qui possède un domaine GTS pour couper, puis se fixe à la colonne
avantages des prot de fusion
- purif = chromato d’affinité
- destination = peptide signal
- facilite le repliement de la prot
- marqueur d’expression = anticorps
