amplification isothermes dÔÇÖADN

Question 1

quelle est l’utilité de la MDA ? (type adn)

Answer 1

= amplification d’ADN en faible quantité
- tumor DNA
- biopsie de tumeurs
- médecine légale..

Question 2

à quoi sert la pyrophosphatase dans la MDA

Answer 2

= permet de dégrader les pyrophosphates libérés lors de l’incorporation des dNTP et éviter qu’ils inhibe l’amplification

Question 3

comment on visualise les brins synthétisés en LAMP

Answer 3

• sur agarose = différentes tailles de séquences
• complexation du PPi et Mg2+ qui créé un trouble
• Sybr green qui s’intercale dans l’ADN puis excitation
• rouge de phénol qui devient jaune si c’est acide donc quand y’a ampli

Question 4

c’est quoi une amplification isotherme? utilité?

Answer 4

T°C constante pendant la manipulation, sans thermocycleur donc moins cher

Question 5

c’est quoi le principe de la TMA

Answer 5

1. ARN cible dans un échantillon incubé avec primer A spécifique + séquence promoteur T7 ajoutée pour RT, primer B sans T7, dNTP, rNTP,
2. synthèse de l’ADNc par la RT via amorce A puis dégradation d’ARN par la RNAse H
3. synthèse de l’autre brin de l’ADNc via l’amorce B pour donner de l’ADNc double brin
4. transcription de l’ADNc en ARN de grande quantité puis synthèse de l’ADNc via la RT avec amorce A, RNAse H, RT avec amorce B, ARN polymérase..
5. boucle pour avoir de plus en plus d’ARN et d’ADNc

Question 6

quelles sont les spécificité de la LAMP

Answer 6

= loop mediated amplification
- forte activité de déplacement
- forte vitesse de poly
- activité 5’-3’ supprimée

Question 7

quel est le principe de la LAMP

Answer 7

1. dénaturation du brin et hybridation de la FIP qui se lie à F2 avec TTTT+F1c overhang
2. synthèse du brin complémentaire jusqu’aux séquences Bx
3. hybridation de F3, synthèse du brin seulement pour dissocier le brin synthétisé de l’amorce FIP
4. l’amorce BIP s’hybride sur le brin dissocié, sur B2 avec B1c overhang et synthétise le brin complémentaire jusqu’aux séquences Fx
5. hybridation de B3, synthèse du brin complémentaire pour dissocier le brin qui sera utilisé pour après avec F1c-F2-F1…B1-B2-B1c
6. hybridation des séquences complémentaires F1c/F1 et B1c/B1 pour créé le dumb-bell
7. élongation à partir de F1 dans le sens 5’-3’ qui synthétise jusqu’à la boucle Bx qui la linéarise
8. la boucle simple brin de la partie Fx peut acceuillir l’amorce FIP = F1c+TTTT+F2 qui va déplacé le brin synthétisé juste avant et permettre à la partie Bx de recréer une boucle
9. élongation à partir de B1 dans le sens 5’-3’ qui synthétisé jusqu’à la boucle Fx
10. la boucle simple brin de la partie Bx peut acceuillir l’amorce BIP qui va déplacer le brin synthétisé juste avant pour permettre de recréer une boucle etc etc etc

Question 8

quelles spécificité pour la MDA

Answer 8

= multiple displacement amplification via la polymérase Phi29 du phage de Bacillus
- forte processivité = répliquer des brins de 30kb
- forte activité de déplacement = hélicase
- fiable et pas d’activité 5’-3’

Question 9

c’est quoi la spécificité de la TMA

Answer 9

= transcription mediated amplification qui utilise 2 enzymes
- RT avec activité ADN poly ARN ou ADN dépendant + actitivté RNAse H
- polymérase

Question 10

principe de la MDA?

Answer 10

1. random hexamere incubés avec ADN, tampon, pyrophosphatase et poly phi29
2. poly des primers jusqu’à trouver un primer et le déshybride du brin = activité déplacement
3. d’autres primers pourront s’hybrider sur le brin dissocié et faire la même chose
4. digestion à l’endonucléase 1 de T7 pour éliminer les ramification non dissociées

Question 11

comment on visualise l’ampli avec la TMA

Answer 11

= hybridation des ARN via des sondes fluorescentes