modification dÔÇÖADN et autres application PCR

Question 1

comment on fait une délétion ou insertion en PCR

Answer 1

• insertion de courte séquence = ajout à l’amorce
• insetion ou délétion de longue séquence = assemblage de gibson

Question 2

exemple avec le facteur de transcription MYC

Answer 2

= MYC impliqué dans la carcniognèse qui présente une Lys conservée qui est acétylée
- remplace par une Arg qui peut pas être acétylée
- on trouve le codon le plus facile à muter pour transformer la Lys en Arg

Question 3

application de la PCR sur l’environnement

Answer 3

= suivre appirtion d’infections, d’épidémies grâce à des microorganismes
- extraction et séquencage provenant d’un échantillons de sol, d’eau

Question 4

comment peut être utilisé la PCR en médical (diagnostic de)

Answer 4

• diagnostic d’infections virales ou bactériennes
• diagnostic et suivis de cancer graces aux ADN circulants = vésicules sécrétées par les cellules cancéreuse donc ADN mutant qu’on peut caractériser

Question 5

quels sont déjà les applications majoritaires de la PCR

Answer 5

• clonage
• modification ADN
• RT pour expression d’un gène
• SNP
• suivre des marqueurs microsat

Question 6

comment se passe le WGA

Answer 6

1. amorces s’hybride partout car courtes et T° peut stringente
2. synthèse des brins complémentaire
3. ajout des séquence ajoutée aux amorces à la séquence pour refaire une PCR plus simple ou séquençage

Question 7

application de la PCR dans l’industrie agro (détection de)

Answer 7

• détection de microorganismes pathogènes dans les échantillons
• détection d’ogm car réglementation stricte
• détection d’allergènes

Question 8

quels sont les techniques pour créer des cassures de l’ADN

Answer 8

= étoposides, UV, IR (ionising radiation)

Question 9

comment on suit la quantité d’ADN pendnat la PCR

Answer 9

= sonde fluorescente SYBR Green qui se fixe sur l’ADN double brin
- thermocycleur spécial qui excite et mesure la fluo pendant l’amplification pour ensuite comparer le nombre de copie dans chaque tube

Question 10

pourquoi modifier les fragments d’un vecteur ?

Answer 10

• mettre en évidence l’importance de nucléotides (promoteurs..), d’aa de protéines (site actif, modif post trad..)
• ajouter une étiquette sur une protéine (purification, reconnaisance anticoprs, protéines de fusion comme la GFP)
  = comparer à des vecteur WT

Question 11

en quoi la Taq permet de faire une error-prone PCR

Answer 11

= utilisation de la Taq poly pour induire des erreurs de réplications
- on peut ajouter des conditions réactionnelles pour induire plus d’erreurs = c° inégale de dNTP ou d’ions bivalents..

Question 12

c’est quoi la PCR quick change ? (sélection)

Answer 12

1. amorces complémentaires entre elles (pour modifier le même site) où on modifie un ou plusieurs nt
2. polymérisation où les amplicons créés possède la mutation
3. sélection du plasmide par la digestion DpnI son GATC seulement si il est méthylé, or les plasmide parentaux sont méthylés donc permet de les différencier
4. transformation des bactéries avec la mutation

Question 13

de quoi est composé le mélange pour le WGA

Answer 13

= whole genome amplification pour amplifier tout le génome
- amorces courtes avec séquence ajoutée avec des inosines pour se lier aux A et C

Question 14

c’est quoi la diff entre PCR qualitative et la Real-Time PCR

Answer 14

• PCR qualitative/en point final = on s’intéresse pas à la quantité mais à la taille du fragment
• Real-Time PCR = comparer le nombre de fragments, donc quantatif pendant les cycles

Question 15

exemples du promoteur LacI et protéines p53

Answer 15

• mutation d’un nt du promoteur LacI ou remplacement de la région -35 pour avoir un taux d’expression beaucoup + fort
• mutation d’un aa de p53 pour empêcher la P et voir ce que ça fait

Question 16

comment on peut étudier l’ADN ancien

Answer 16

= ADN extrait de sources variées, fouilles archéo, collections de musées
- dans les dents, os
- difficultés car ADN degradé

Question 17

comment se passe pour une PCR avec les amorces décalées

Answer 17

= nécessité de ligation via des kinases et ligases car les amorces n’ont pas de P

Question 18

comment on induit des substitution dirigées ?

Answer 18

= erreurs voulues introduites dans l’amorce utilisé en PCR, sur une séquence parfaitement connue
- utilisation de polymérase fiables avec activité exonucléase pour ne pas introduire plus d’erreurs

Question 19

c’est quoi la sonde Taqman

Answer 19

= amorce qui s’hybride sur l’ADN cible qui possède un fluorochrome en 5’ et un “quencher” en 3’
- fluorescence du fluorochrome pas visible car le quencher absorbe tout
- quand la PCR fonctionne, la Taq poly degrade la sonde, le quencher est séparé du fluorochrome et on peut mesurer la fluo

Question 20

comment on fait pour identifier les mutants ?

Answer 20

= on les intègre dans des vecteurs d’expression pour mesure l’activité biologique des différents mutants
- puis séquencer et identifier la localisation de la mutation

Question 21

pourquoi c’est chiant de faire une PCR

Answer 21

= les amorces peuvent d’hybrider entre elles donc réduit l’efficacité

Question 22

c’est quoi la mutagénèse aléatoire par PCR (nom)

Answer 22

= error-prone PCR qui génèse des mutations aléatoires pour créer des banques de mutants
- besoin d’une méthode de criblage haut débit des mutants (enzymes avec subtrat coloré..)