Processamento Histológico

Question 1

quais sao as 3 etapas ?

Answer 1

● Desidratação: realizada pelo etanol, sendo que este tem concentrações a 70%, 96% e 100%, pois queremos que
exista uma remoção progressiva da água e não uma retirada abrupta da
mesma, senão ocorrem distorções.
● Diafanização ou Clarificação: realizada pelo xileno, sendo que este só tem uma concentração.
● Impregnação: realizada pela parafina, sendo que esta à temperatura ambiente é solida e, primeiramente, precisamos de aquecê-la para que esta possa penetrar nos tecidos. O meio de impregnação deve ser o mesmo que o de inclusão.

Question 2

como ocorre a saida de reagentes durante o processamento histologico ?

Answer 2

anteriormente os orgaos foram colocados em formalina para fixar. depois dos fragmentos ja cortados vamos colocar em etanol para retirar a formalina, depois em xileno para tirar o etanol e por ultimo em parafina para tirar o xileno.

Question 3

o que é a desidratacao ?

Answer 3

• Na desidratação utilizamos concentrações crescentes de etanol (70, 96 e 100%).
• Etapa que sucede a fixação.
• Primeira etapa do processamento histológico, se a fixação for considerada como processo de conservação.
  Nota: Há autores que consideram que a fixação está inserida no processamento
  histológico.
• Objetivo: retirar a água existente nos tecidos (água da solução aquosa de formalina),
  pois a água é incompatível com a parafina que é o agente final deste processo.

Question 4

o que é o metodod quimico ?

Answer 4

Na desidratação, o método químico trata-se da utilização de solventes orgânicos que
apresentam uma grande solubilidade com a água, permitindo a extração e substituição desta.
O desidratante ideal é:
* Solúvel em água.
* Solúvel em parafina.
Se fosse possível termos um desidratante simultaneamente solúvel em água e em
parafina, ou seja, um desidratante ideal, fazia-se a passagem direta da desidratação para a
impregnação.

Question 5

o que é o etanol ?

Answer 5

• C2H6O
• Forma “pura” – etanol/álcool absoluto (a 100%). No entanto, normalmente, pede-se etanol 99,5% no limite 99,8% para os laboratórios, o que não é na verdade
  completamente álcool absoluto.
• Muito solúvel em água.
• O mais utilizado em AP como agente desidratante.
• Etanol “industrial” possui elevado grau de impurezas – mas é considerado 100% puro
  para AP.
• Inflamável e volátil.
• Provoca uma retração no tecido e endurecimento (rápido), especialmente o mais puro (a 100%).
• Não é miscível com a parafina (e por isso é que precisamos depois do xileno).
• Etanol 70% - provoca menor retração – os fragmentos podem permanecer durante mais tempo.
  Nota: Existem 12 etapas e a etapa onde podemos deixar os fragmentos permanecer
  mais tempo é no etanol a 70%, porque este tem ainda uma boa quantidade de água,
  não ocorrendo efeitos nefastos para os tecidos.
• Etanol 95% devolve as cores dos tecidos, anteriormente à fixação – bom para tirar
  fotografias.

Question 6

o que é o isopropanol ?

Answer 6

• C3H8O
• Álcool isopropílico (tipo de álcool mais puro que o normal)
• Inflamável
• Ação mais lenta e tolerante que o etanol – menor retração dos tecidos (sendo, por isso,
  um reagente mais estável).
• Não dissolve os corantes solúveis em etanol.
• Não é miscível com a parafina.
• Não dissolve a celoidina (meio de impregnação/inclusão).

Question 7

o que é acetona ?

Answer 7

• CH3(CO)CH3
• Propanona.
• Pode utilizar-se como agente desidratante quando a rapidez é um fator importante. No
  entanto, uma desidratação muito rápida leva a que as desvantagens apareçam também muito rápido, logo a acetona não é muito utilizada pela razão apresentada no último ponto*.
• Inflamável.
• Muito volátil.
• Mais rápida que o etanol.
• Não é miscível com a parafina.
• *Tem tendência a endurecer os tecidos, se a desidratação for longa.

Question 8

o que é dioxano ?

Answer 8

• C4H8O2
• 1, 4-Dióxido de dietileno
• Agente desidratante ideal, sendo solúvel tanto na água comona parafina.
• Altamente inflamável.
• Perigo de explosão (peróxidos).
• Muito tóxico por inalação e via cutânea.
• Preço muito elevado.

Question 9

o que é tetrahidrofurano ?

Answer 9

• OC4H8
• Óxido de dietileno, Óxido de tetrametileno ou THF.
• Agente desidratante ideal, sendo solúvel tanto na água como na parafina.
• Altamente inflamável.
• Perigo de explosão (peróxidos).
• Menos tóxico que o dioxano.
• Ação muito rápida.
• Danifica pouco os tecidos.

Question 10

o que é a diafanização ?

Answer 10

• Consiste na substituição do agente desidratante no tecido, normalmente etanol, por um
  solvente da parafina.
• É um processo de clarificação, uma vez que após a sua ação os tecidos ficam transparentes (provocado pelo elevado índice de refração).

Question 11

o que é xileno ?

Answer 11

• C6H4(CH3)2
• Dimetil benzeno.
• A solução comercial é constituída por uma mistura de orto-, meta- e paraxilol.
• Diafanizador mais utilizado no processamento e coloração.

Question 12

quais sao as vantagens e desvantagens do xileno ?

Answer 12

Vantagens
* É o mais rápido (30 min. a 1h).
* Endurece pouco os tecidos.
* Eliminação fácil dos tecidos.
* Fácil observação do fim do processo (manualmente).
* Não dissolve a celoidina.
Desvantagens
* Aclara os tecidossomente a partir do etanol absoluto (pois este não é miscível em água).
* Endurece os tecidos por exposição longa.
* Tendência para endurecer tecidos fibrosos, musculares e cartilagíneos.
* Torna os tecidos quebradiços.
* Tendência para acidificar. Por este motivo só colocamos o fragmento até ao tempo
estritamente necessário.

Question 13

o que é tolueno ?

Answer 13

• C6H5CH3
• Metil benzeno
• Considerado o diafanizador ideal por muitos técnicos.

Question 14

quais sao as vantagens e desvantagens do tolueno ?

Answer 14

Vantagens
* É rápido (1 a 2h).
* Endurece menos os tecidos que o xilol.
* Não torna os tecidos quebradiços.
* Tolerância de mais de 12h para os tecidos.
* Fácil observação do fim do processo.
* É mais volátil que o xileno, sendo esta uma forma de ser eliminado depois da parafina.
* É mais tolerante à contaminação da água.
Desvantagens
* Aclara os tecidos somente a partir do etanol absoluto.
* Tendência para acidificar, no entanto, tem maior tolerância à água do que o xileno.

Question 15

quais sao as vantagens e desvantagens do benzeno ?

Answer 15

Vantagens
* É relativamente rápido (1 a 3h).
* Endurece muito pouco os tecidos.
* Não torna os tecidos quebradiços.
* Provoca pouca retração.
* É muito volátil, evapora-se rapidamente do banho de parafina, diminuindo a frequência de mudança desta.
Desvantagens
* É cancerígeno, afeta sobretudo sangue e medula óssea, podendo a longo prazo
desenvolverem-se anemias.
* Endurece tecidos fibrosos, músculo e tendões.
* Difícil manutenção do nível de volume nos processadores abertos.
* Não é muito utilizado.

Question 16

quais sao os fatores que inflenciam a desidratacao e a diafanizacao ?

Answer 16

• Concentração do agente desidratante
• Volume dos agentes desidratantes e diafanizadores
• Tamanho e consistência do fragmento
• Duração
• Temperatura
• Vácuo
• Agitação

Question 17

quao importante é a concentracao do desidratante ?

Answer 17

Para uma desidratação o mais completa possível é necessário:
* Imersões com concentrações crescentes – método gradual (70, 96 e 100), para evitar
retração.
* Últimas imersões com a substância no estado puro, sendo que, assim, nos certificamos que vamos remover toda a água.
* Mudança periódica: a água retirada dos fragmentos vai diminuir a concentração.
Temos 3 recipientes a 100%, pois é o reagente no estado mais puro. O primeiro
recipiente a 100% retira a água que resta dos fragmentos, o seguinte ainda retira alguma água do fragmento e o último é aquele que retira completamente a água que ainda possa existir.
Assim, queremos assegurar-nos que não existe água em nenhuma zona, senão o xileno não conseguirá penetrar nessa zona, ficando lá um buraco.

Question 18

quao importante é o volume dos agentes desidratantes e diafanizadores ?

Answer 18

• Quanto maior a quantidade de fragmentos, maior será a quantidade de substância a ser
  utilizada.
• Quanto maior o número de imersões → maior eficácia.
• Imersão de grande volume VS imersões de volumes pequenos.
  Várias imersões em vez de uma só são mais eficazes.
  A água é mais densa que o etanol, portanto no caso do recipiente maior, como não
  haverá agitação por 3 horas as cassetes que estão no fundo vão estar em contacto com água esse tempo todo e, em consequência, vão estar sempre hidratadas.
  Logo, é preferível passar de volume pequeno em volume pequeno do que ter apenas
  uma imersão única num grande volume.
  Já no caso da diafanização (onde se tira etanol e se coloca xileno), o xileno é mais denso
  que o etanol. Não é benéfico ter agitação, porque o que se deseja é que o xileno esteja sempre em contacto com as cassetes e que o etanol esteja mais no topo do recipiente.

Question 19

quao importante é o tamanho e consistencia dos fragmentos ?

Answer 19

• Fragmentos maiores – difusão dos reagentes mais difícil.
• Maior quantidade de água/etanol.
• Lípidos: maior dificuldade de penetração dos reagentes.
• Tecidos fibrosos e densos são mais difíceis.

Question 20

como deve ser calculada a duracao da desidratacao e diafanizacao ?

Answer 20

• Duração: o tempo necessário até equilibrar as proporções água/etanol ou etanol/xileno.
• Quando o equilíbrio é atingido (proporção igual) retiram-se os fragmentos de forma a
  minimizar a retração e o endurecimento.
• Etanol 100% – fragmentos quebradiços.
  Nota: Dentro do processamento histológico é preferível deixar os nossos fragmentos em etanol a 70% que é o que tem mais água, sendo esta o componente natural dos tecidos.

Question 21

como influencia a temperatura ?

Answer 21

• Aumento da temperatura acelera as reações.
• Aumenta os efeitos negativos: retração e endurecimento.
• Aumenta o perigo de incêndio.
• A evaporação do agente desidratante, mais volátil que a água, leva à hidratação.

Question 22

como influencia o vacuo ?

Answer 22

• Não tem efeitos na duração das etapas.
• Ajuda a retirar o ar dos tecidos.

Question 23

como influencia a agitacao ?

Answer 23

• Influencia a desidratação, sendo benéfico.
• Agitação constante: desidratação mais rápida e eficiente.
• Sem agitação: a água é mais densa deposita-se no fundo do recipiente – fragmentos
  hidratados.
• A agitação durante a diafanização possui efeitos negativos.
• O xilol é mais denso que o etanol.
• Não agitar permite que o diafanizador fique separado do etanol.

Question 24

quais sao os efeitos de tempo a excesso e tempo a menos nestas etapas ?

Answer 24

• Permanência longa: endurece excessivamente o tecido (verificamos que está duro
  durante a microtomia).
• Permanência curta: os efeitos fazem-se sentir nas etapas seguintes a curto ou a longo
  prazo (verificamos durante a microtomia e no arquivo).

Question 25

quais sao os efeitos a curto prazo ?

Answer 25

• Fragmento com consistência heterogénea (sem suporte interno), dificultando o corte.
• A água/etanol restante no tecido, devido à sua incompatibilidade com o meio de impregnação, não permite que este entre no mesmo.

Question 26

quais sao os efeitos a longo prazo ?

Answer 26

• É possível o corte, num fragmento de consistência reduzida.
• Em contacto com o ar, a água/etanol evapora, o tecido retrai e separa-se da parafina
  envolvente (bloco).Se, por exemplo, houver um problema com a desidratação onde esta foi mal feita retiramos a parafina e depois colocamos o bloco no xileno para tirar a parafina presente lá de dentro. Tecidos de dentro ficam com xileno e depois passamos para o etanol a 100% (pois tem 0% de água), deixamos ficar uma horas e, por fim, voltamos a fazer o processamento todo outra
  vez

Question 27

o que é a impregnacao ?

Answer 27

• Consiste no preenchimento dos espaços vazios, anteriormente ocupados por xileno, por substâncias que irão proporcionar uma consistência firme.
• O meio utilizado na impregnação deve ser igual ao meio utilizado na inclusão.
• A substância mais utilizada na impregnação é a parafina.
• Existem outros meios de impregnação, tais como: celoidina (é um meio solúvel em solventes e não é necessária fonte de calor), gelatina, ceras esterificadas e polietileno.

Question 28

o que é parafina ?

Answer 28

• CnCH2n+2
• Sólida à temperatura ambiente.
• Substância branca cristalizada e gordurosa (nós temos em forma de pallage).
• Constituída por carbonetos saturados que se encontram nos resíduos de destilação do
  petróleo.
• Insolúvel na água e no etanol.
• Solúvel nos agentes diafanizadores (único em que esta é solúvel).
• Pontos de fusão variáveis, no entanto, devem ter um ponto de fusão de cerca de 35℃
  superior à TA.
• Funde quando colocada a temperatura superior ao seu ponto de fusão, não superior a
  60℃.
  Não regular os banhos-maria para 60℃, porque é onde ocorre a extensão e isto pode
  retirar parafina do nosso tecido e o tecido começa a encolher.

Question 29

quais sao os aditivos para melhorar a eficacia da parafina ?

Answer 29

• Polímeros plásticos
• Borracha
• Cera de abelhas

Question 30

o que fazem os polimeros plasticos ?

Answer 30

• Aumentam a consistência e elasticidade.
• Aumentam a flexibilidade.
• Aumentam a durabilidade.
• Permitem cortes finos uniformes e em série.

Question 31

o que faz a borracha ?

Answer 31

• Aumenta a elasticidade.
• Aumenta a sustentação da amostra.
• Impede a formação de rugas.

Question 32

o que faz a cera de abelhas ?

Answer 32

• Propriedades físicas semelhantes às da parafina
• Recurso renovável
• Fornece consistência para um corte uniforme
• Aumenta a elasticidade
• Evita rugas nos cortes

Question 33

o que é a celoidina ?

Answer 33

• É constituída por nitrocelulose.
• É utilizada dissolvida em éter + etanol. (Éter causa desmaios e ambos, o éter e o etanol,
  são inflamáveis.)
• Esta técnica não utiliza calor, pois consiste na evaporação do solvente.
• Diminui a retração.
• Ideal para órgãos inteiros, osso descalcificado, olhos (a parafina descola a retina) e
  tecido nervoso.
• A técnica é muito lenta (várias semanas).
• Cortes com espessura superior a 10-15 mm. (cortes para impregnação)
• Arquivo dos blocos em etanol – pouco prático, pois o arquivo é feito com etanol, mas
  este evapora.
• Celoidina + solventes = inflamabilidade.

Question 34

o que é gelatina ?

Answer 34

• Substância derivada da hidrólise do colagénio (é um glícido, logo quando o bloco é
  arquivado, como ela tem a sua componente de açúcares, pode existir a contaminação
  por microrganismos).
• Dá suporte a tecidos delicados e fragmentos muito pequenos
• Gelatina a 25%
• Endurece-se o bloco em formaldeído a 10% antes do corte
• Corte difícil

Question 35

o que sao ceras esterificadas ?

Answer 35

• Ponto fusão inferior à parafina.
• Permitem um corte mais fino.
• Endurecimento deve ser feito progressivamente – retração do tecido.
• Custo elevado.

Question 36

o que é polietileno ?

Answer 36

• Polímero simples e inerte.
• Ceras hidrossolúveis. Trata-se de uma cera solúvel em água que seria algo ótimo, porque
  não precisaríamos de processamento histológico, logo seria mais rápido, mas não são usadas porque não dão bons resultados.
• Carbowax (mais conhecida).
• Passagem direta da fixação para a impregnação (1 Carbowax 4000: 9 Carbowax 1500).
• Com este método é possível preservar substâncias solúveis nos solventes orgânicos. Por
  exemplo: os lípidos que são muito bem fixados com formalina, mas removidos pelos
  solventes orgânicos etanol e xileno.

Question 37

quais sao os fatores que influenciam a impregnacao ?

Answer 37

• Agente diafanizador – relacionado com a volatilidade
• Temperatura
• Vácuo

Question 38

como influencia o agente diafanizador na impregnacao ?

Answer 38

• A solubilidade com a parafina condiciona a rapidez da sua eliminação.
• A volatilidade do diafanizador, faz com que este desapareça mais lenta ou rapidamente
  do banho de parafina.
• Temos o benzeno que desaparece mais rapidamente, mas não é usado por ser
  carcinogénico, por outro lado, o xileno e o tolueno ao desaparecerem fazem com que
  parafina fique menos contaminada.

Question 39

como influencia a temperatura na impregnacao ?

Answer 39

A temperatura da parafina é muito importante porque:
* Temperatura alta – provoca retração e dureza dos fragmentos, dificultando o corte
* Temperatura baixa – não se dá a impregnação (parafina está solida)
* Durante a impregnação: 60 ℃.

Question 40

como influencia o vacuo na impregnacao ?

Answer 40

• Eliminação de bolhas de ar.
• Eliminação do agente diafanizador.
• Facilita a penetração da parafina.

Question 41

quais sao os efeitos de uma ma impregnacao ?

Answer 41

• Demasiado longa – Retração e endurecimento dos fragmentos.
• Demasiado curta – Fragmentos com consistência heterogénea → dificuldade no corte (há zonas que ficam esbranquiçadas)

Question 42

quais sao os tipos de processamento ?

Answer 42

O processamento mais comum em AP, atualmente pode ser realizado de 3 formas:
* Manual
* Automático
* Microondas

Question 43

quais sao as vantagens e desvantagens do processamento manual ?

Answer 43

Vantagens
* Os fragmentos podem variam de tamanho.
* Controlo da diafanização (só é possível neste tipo de processamento)
* Não há problemas com avarias e falta de energia elétrica.
Desvantagens
* Moroso.
* O técnico fica sujeito a maior contacto com os agentes químicos prejudiciais.
* Não realiza programas de fim de semana e outros especiais.
* Não realiza vácuo, agitação, etc.
* Erro humano.

Question 44

quais sao as vantagens e desvantagens do processamento automatico ?

Answer 44

Vantagens
* Rápido.
* Agitação, vácuo, aquecimento.
* Tratamento homogéneo (passam todos pelas mesmas condições).
* Programas ao fim de semana, feriados, overnight.
* Diminui o erro humano.
* Diminui a exposição do técnico a agentes químicos perigosos.
* Tempo investido noutras atividades laborais.
Desvantagens
* Falta de energia elétrica.
* Anomalias nos aparelhos.
* Não há um controlo visual por parte do técnico, ex.: fim da diafanização.
* Homogeneidade das amostras requerida para estarem adaptadas ao programa.