priprava biološkega preparata Flashcards
HE barvanje
Hematoksin: Jedra (modro - vijolično)
Eotin: citoplazma (rožnato)
Fiksativi za svetlobno mikroskopijo:
fiksacija = zaustavitev življenskih procesov
KEMIJSKI FIKSATIVI
-aldehidi (formaldehidi)
kovalentno zamreženje proteinov
-alkoholi (etanol)
obarjanje, agregacija
-kisline (ocetna kislina)
denaturacija
RAZTOPINE
-formalin
Postopek priprave histološkega preparata:
1) FIKSACIJA
fiksativ (npr. formaldehid)
izpiranje fiksativa
2) VKLOP
dehidracija z etanoli (50, 70, 90 in 100%)
vosek nepolaren, zato se moramo znebiti vode
odtegnitev alkohola z ksilolom
prepojitev s parafinom
3) REZANJE
z mikrotomom
4) BARVANJE
deparafiniranje s ksilolom
hidracija (100, 90, 70, 50% etanol-voda)
izpiranje barvil
5) POKRIVANJE
dehidracija z etanoli (50 do 100%)
odtegnitev alkohola z ksilolom
vklapljanje v umetno smolo (naredi preparat trajen, lomni količnik enak kot steklo 1,5)
krovno stekelce
trajni histološki preparat iz zaledenelih rezin
hitreje saj ni potrebno 2x dehidrirati
možnost 1
# fiksativ
# spiranje fiksativa
krioprolektant (preprečuje, da bi kristali poškodovali tkivo)
zamrzovanje (kriostat)
kriomikrotom
možnost 2
# fiksativ
# spiranje fiksativa
barvilo
izpiranje barvila
dehidracija z etanoli
odtegnitev alkohola z ksiolom
vklapljanje v umetno smolo
krovno stekelce
alciansko barvilo
+ nabito
kisli proteoglikani v čašastih črevesnih celicah in na površini črevesnega epitelija
(tam da hrana lažje zdrsi: manj trenja)
stokov premik
stokov premik= razlika dveh vrhov
-eksitacijski vrh (vrh vzbujanja, vzbudimo fluorokrom)
-emisijski vrh
FLUORESCENČNI MIKROSKOP
dodatni elementi
fluorokromi
FLUORESCENČNI MIKROSKOP
dodatno ima: filtrski blok in žarnico, ki lahko izseva različne valovne dolžine (LED)
prepušča le določene valovne dolžine (ne prepušča kratkih, ki bi poškodovale oko)
tri različne barve: trije različni filtrski bloki, računalniško združimo sliki
Fluorokromi, kot označevalci v fluorescenčni mikroskopiji:
- protitelesa
lektini (= proteini, ki se vežejo na glikokaliks)
sonde (=DNA, RNA sonde in FISH tehnika)
faloidin (= toksin iz zelene mušnice, veže na aktin)
+ fluorokrom
-samostojna barvila (fluorokrom DAPI: veže v veliko kotanjo DNA)
-genski konstrukti (fluorokrom GTP in izpeljanke)
FITC: emitira zeleno
TRITC: emitira rdelče
-lipidni analogi (+ fluorokrom)
transfekcija
načini transfekcije
transfekcija= vnos rekombinantnih nukleinskih kislin (genskega konstrukta) ali proteinov v celico
npr, vnesemo gen za zeleni fluorescenčni protein (GFP): reporterski gen
Načini transfekcije:
-lipofekcija
-elektroporacija (majhne luknje v plazmalemi)
-virusna transdukcija
-jedrna mikroinjekcija
KONFOKALNI MIKROSKOP
KONFOKALNI MIKROSKOP
signal svetlobe je točkast (“pinhole”)
visoka intenziteta svetlobe (laser)
skeniranje
slika na monitorju (nikoli ne pod okularjem)
točkasta osvetlitev objekta
emitirana svetloba:
samo tista, ki izhaja iz točke fokusa doseže detektor
ostalo blokira “pinhole” zaslonka
optično rezanje s konfokalnim mikroskopom
skladovnica optičnih rezin- 3D modeliranje
fluorescenčna vs konfokalna
debelina rezine
področje ostrine
širokopoljna fluorescenčna mikroskopija: vidimo jasno kar je v fokusu
debelina optične rezine: 2-3μm
področje neostrine: veliko
konfokalna: na detektor pade samo fluorescenca, ki je v fokusu (ravnini)
debelina optične rezine: 0,5 μm
področje neostrine: majhno
ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA
sestavni deli mikroskopa
vir za gledanje= elektroni
elektronska puška
elektromagnetno lečje: tuljave
naš preparat
projektivne leče: povečajo sliko in skoncentrirajo el
čip
el. puška:
el iz katode izsevajo, anoda (+) jih privlači in sfokusira v snop
umes Wehneltov cilinder, ki naprej spusti samo pravilno usmerjene el
sistem je vakumiran: ni drugih delcev, na katerih bi se lahko sipali el
ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA
zakaj je ločljivost boljša
preparati
sipanje el
ločljivost boljša ker:
el imajo višjo energijo
valovna dolžina el je: 0,005nm
d= 0,61λ / Na
ločjivost: 0,3 do 1nm
za elektronski: 240nm
Preparati za presevni EM:
-preprečene spremembe struktur (zato jih fiksiramo)
-suhi (ker imamo vakum)
-tanki (40 do 80nm)
-kontrastni
k sliki prispevajo el, ki presevajo: tam je belo
tisti, ki sipajo, ne pridejo do konca: tam je črno
sipanje je odvisno od:
-debeline preparata
-gostote materiala
-atomske mase (če je majhno jedro se el slabo sipajo)
-energije el
kemijska fiksacija ultratankih rezin
1) primarna fiksacija
fiksiramo proteine, jih zamrežimo
fiksativ= FA + GA
formaldehid (ena prosta CHO), reverzibilen
glutaraldehid (dve prosti CHO, ireverzibilen)
2) sekundarna fiksacija: postfiksacija
lipidi: membrane
OsO4
reagira z dvojnimi vezmi v lipidih (nenasičeni) -> črno
postopek priprave ultratankih rezin za presevni EM
-FIKSACIJA
kemijska fiksacija (formaldehid, glutaraldehid)
izpiranje fiksativa
postfiksacija (OsO4)
- VKLOP
dehidracija z etanolom (50, 70, 90 in 100%)
propilen oksid
prepajanje z umetno smolo (Epon)
polimerizacija umetne smole
- REZANJE
ultramikroton (diamanten nož)
poltanke, ultratanke rezine
-KONTRASTIRANJE
kontrastiranje (Pb citrat, U acetat)
spiranje
sušenje
izdelava piramide iz eponskega bloka
izdelamo piramido
najprej režemo poltanke rezine 1μm
nato izberemo del, ki ga želimo gledati in samo ta del narežemo ultratanko
poltanko v enem koraku pobarvamo z Toluidinskim modrilom
opazujemo pod svetlobnim mikroskopom
na mrežico damo do 5 ultratankih rezin
namesto barvanja imamo kontrastiranje (povečamo bariero, okrog katere se elektroni sipajo)
bistvo presevnega EM: vidimo ultrastrukturo
krioelektronka mikroskopija
ločljivost do 4nm
kriofiksacija: ohranimo nativno stanje
VRSTIČNI ELEKTRONSKI MIKROSKOP
notranjost nas ne zanima, pri pripravi ni rezanja
vzorci so lahko veliki (nosilec je en kvadratni cm)
primarni snop el izbija sekundarne el, ki so na preparatu: te zazna detektor
priprava preparatov za vrstični elektronski mikroskop
-FIKSACIJA
kemijska fiksacija (formaldehid, glutaraldehid)
izpiranje fiksativa
postfiksacija (OsO4)
-SUŠENJE (ni fiksacija!, namen da se znebimo vode)
dehidracija z acetonom (50, 70, 90 in 100%)
prepajanje s tekočim CO2
sušenje pri kritični točki CO2
-NAPRAŠEVANJE
površina se enakomerno prekrije s tanko plastjo prevodne kovine (zlato, platina)
množina izbitih el je večja kot na nenaprašenem vzorcu
na vrhovih se izbije več sekundarnih el: bele površine
puška otipava površino?
