označevanje celičnih sestavin Flashcards
celične sestavine in njihovo označevanje
proteini
nukleinske kisline
ogljikovi hidrati
lipidi
-PROTEINI
strukturni: imunooznačevanje
encimi: imunooznačevanje, encimska histokemija (gledanje encimske aktivnosti)
-NUKLEINSKE KISLINE
Feulgenova reakcija
-OGLJIKOVI HIDRATI
polisaharidi, glikoproteini, glikolipidi, nevtralni proteoglikani: reakcija PAS
kisli proteoglikani: Alciansko modrilo
-LIPIDI
OsO4, barvila Sudan
umestitev reakcije v protokol priprave preparata- parafinske rezine
- možnost: pred fiksacijo
- možnost: po fiksaciji in rezanju
reakcija PAS
REAKCIJA PAS
dokazovanje sladkorjev, nebtralnih proteoglikaov
- korak:
+ jodova kislina HIO4 -> oksidacija, izpostavijo se CHO skupine - korak:
+ Schifov reagent
reagira z prostimi CHO skupinami -> vijola/roza obarvanje
encimska histokemija
dokazovanje aktivnosti encimov v celicah
osnovni princip:
rezina + eksogeni substrat -> primarni reakcijski produkt +reagent -> končno obarvan produkt
dokazovanje kisle fosfataze (KF)
KF markerski encim za lizosome
substat + KF -> primarni RP + reagent -> končni RP
končni RP
- obarvan (azobarvilo)
-ali elektronsko gost za presevni EM (Pb-fosfat)
postopek imunooznačevanja
direktna metoda:
inkubacija z označenim protitelesom proti antigenu
poliklonska protitelesa: prepoznajo več epitopov
monoklonska: prepozna 1 antigen, epitop
indirektna:
namenjena ojačitvi signala
več označenih 2nd protiteles vezanih na primarno
označevalci protiteles v imunohistokemiji
-fluorokromi: fluorescenčni, konfokalni mikroskop
-biotin
-encim
+ substrat -> PRP + reagent -> obarvan produkt
-koloidno zlato
presevni EM, različne velikosti, lahko označimo več stvari
in situ hibridizacija
dokazovanje specifičnih nukleotidov nukleinskih kislin
vezava sonde na komplementarno zaporedje
sonda označena z :
-fluorokromi
-radioaktivnimi izotopi
-sintetičnimi antigeni
lektinska histokemija
dokazovanje specifičnih sladkornih preostankov na glikoproteinih
vezava lektina na sladkorni preostanek
označevalci sond:
-fluorokromi
-encimi
-koloidno zlato
avtoradiografija
za ugotavljanje podvajanje DNA in vitro
v celico/žival vgradiš radioaktivne izotope
elektronska tomografija
el tomografija= 3D rekonstrukcija celičnih struktur na nivoju presevne el. mikroskopije
skladovnica rezin (slik) = tomogram
zamik za 1 stopinjo
kriometode v elektronski mikroskopiji
ohranimo tkivo kot je v telesu
1) kriofiksacija in kriosubstitucija
2) izdelovanje krioultratankih rezin
3) krioelektronska mikroskopija
4) zamrzovalno lomljenje
kriofiksacija
načini
kriosubstitucija
načini kriofiksacije:
-potopitveno zamrzovanje
-udarno zamrzovanje
-visokotlačno zamrzovanje
kriofiksacija za 200μm
HPF visokotlačno zamrzovanje
lahko dodamo OsO4 za ohranitev lipidov
kriosubstitucija
-dehidratacija (aceton ) -90 do -60 stopinj
-epon
osnova za elektronsko tomografijo
prednosti kriofiksacije (v primerjavi z kemijsko)
+ohranjena ultrastruktura
+homogena citoplazma
+ni dilatacije veziklov
+ni gubanja membran
bližje stanju in vivo
izdelovanje krioultratankih rezin
krioultramikroton (za presevno EM)
imunooznačevanje (metoda po Tokuyasu)
koluidno zlato na protitelesih
krioelektronska mikroskopija
stalno v krio pogojih
kriogene temp -100 do -200
analiza posameznih delcev
zamrzovalno lomljenje
kemijska fiksacija (GA)
krioprotektant (glicerol)
zamrzovanje
lomljenje
napraševanje
čiščennje replike
TEM
nož naključno zlomi naš vzorec, tam kjer so najšibkejše vezi (pri plazmalemi)
navadno transmembranski proteini ostanejo v citoplazemskem delu
del ki ostane se pod določenim kotom napraši z platino
izpostavljeni deli imajo več platine
nato se enakomerno napraši z ogljikom (da se vse skupaj učvrsti)
dobimo relief
odstranimo organski material-> dobimo replike
korelativna mikroskopija
kombiacija svetlopne in elektronske (CLEM)
