Principes de laboratoire Flashcards
Qu’est-ce qu’une solution?
Mélange homogène d’un soluté et d’un solvant
Qu’est-ce qu’une solution électrolytique?
Permet le passage de l’électricité grâce à la présence d’ions
Qu’est-ce qu’une solution non-électrolytique?
Ne permet pas le passage de l’électricité en raison de l’absence d’ion
Quels sont les types d’eau utilisée en biologie?
Eau de ville
Eau déionisée ou permutée
Eau distillée et bidistillée
Eau milli-Q
Quelles sont les caractéristiques de l’eau de ville?
Présence de matière organique et concentration en ions variable
Traitement pour assurer la sécurité des consommateurs
Quelles sont les caractéristiques de l’eau déionisée ou permutée?
Eau dont on a retiré les ions positifs et négatifs
Matière organique présente
Quelles sont les caractéristiques de l’eau distillée et bidistillée?
Obtenue grâce à la vaporisation/condensation
Présence d’une très faible concentration d’impuretés
Quelles sont les caractéristiques de l’eau milli-Q?
Eau ultra pure
Purifiée par un système complexe de filtres/résines/membranes très coûteux
Qu’est-ce que la concentration massique volumique?
Rapport entre la masse d’un soluté dissout et le volume total de la solution
Exprimé en g/ml ou g/L
Quel est le calcul associé à la concentration massique volumique?
C=m/V
Concentration = masse/volume
Qu’est-ce que la concentration en pourcentage?
Rapport massique, volumique ou massique volumique pour 100
Qu’est-ce que la concentration molaire ou la molarité?
Nombre de moles par litre de solution
Exprimée en M ou mol/L
Quel est le calcul associé à la concentration molaire?
C = n/V
Concentration = nb d’Avogadro/volume
Qu’est-ce que la mole?
Unité de mesure qui correspond à 6,022x10^23 particules
Qu’est-ce que la masse molaire?
Masse d’une mole
Exprimée en g/mol
Qu’est-ce que la masse molaire atomique?
Masse atomique exprimée en unités atomiques (u)
Qu’est-ce qu’un Dalton?
Représente le 1/12 de la masse d’un atome de carbone
Qu’est-ce que la normalité?
Mesure ambigüe qui correspond au nombre d’équivalents de soluté par litre de solution
Qu’est-ce qu’un équivalent?
Nombre de portions acides ou basique nécessaires pour amener la solution à l’équilibre
Quel est le calcul associé à la normalité?
N = molarité/facteur d’équivalence spécifique à la réaction chimique
Quelles sont les caractéristiques d’une solution tampon?
La dilution du tampon ne modifie pas ou peu peu son pH
L’addition de petites quantités d’acide fort ou de base forte ne fait pas changer le pH de façon significative
Qu’est-ce que le pKa?
Constante qui mesure la tendance d’un acide à libérer un proton (H+)
Qu’est-ce que le pKb?
Constante qui mesure la tendance de la base conjuguée à accepter un proton (H+)
Dans quel intervalle se situe l’efficacité d’un tampon?
À + ou - 1 unité de pH du pKa
Quel est la préparation idéale des tampons?
Préparation à l’aide de l’acide/base et de sa base/acide conjuguée
Quels sont les colorants utilisé pour la mesure du pH?
Vert de Bromocrésol (pKa = 4,7)
Rouge de Phénol (pKa = 7,9)
Comment fonctionne le pH mètre et la sonde à pH?
Grâce à une membrane de verre sensible au H+
L’activité des ions H+ est mesurée via des différences de potentiel électrochimique entre l’électrode de mesure et la référence
Pourquoi la purification nécessite plusieurs étapes?
Parce qu’à chaque étape, une classe de contaminant est éliminée
Quel est la première étape de la purification?
Lyser les cellules pour libérer leur contenu dans un tampon de lyse
Dans le cas de cellules, quelle est la méthode d’extraction à privilégier?
Retirer le milieu de croissance et resuspendre dans le tampon de lyse
Cellule en suspension : centrifugation à basse vitesse
Cellule adhérente : trypsinisation suivie d’une centrifugation
Dans le cas de tissus, quelle est la méthode d’extraction à privilégier?
1er traitement grossier sans tampon
Traitement suivants dans un tampon de lyse
Quelles sont les méthodes d’extraction mécanique?
Mortier et pilon
Mélangeur
Homogénéisateur de type rotor-stator
Homogénéisateur de type Dounce et Potter-Elvehjem
Homogénéisateur à bille (bead beater)
Homogénéisateur à haute pression
Sonication
Quelles sont les caractéristiques du mortier et du pilon?
Surtout utilisé comme pré-traitement pour les tissus rigides
Souvent combiné à l’azote liquide pour faciliter le broyage des tissus
Peu couteux, mais lent
Préservation des biomolécules
Doit être combiné à d’autres méthodes pour arriver à une lyse cellulaire efficace
Quelles sont les caractéristiques du mélangeur?
Lames rotatives à haute vitesse
Surtout utilisé pour le prétraitement des tissus animaux ou végétaux durs
Idéal pour les grands volumes
Peu adapté pour les petits volumes
Peu coûteux
Attention à la chaleur
Quelles sont les caractéristiques de l’homogénéisateur de type rotor-stator?
Très grande variété de modèles
Rapide et efficace
Homogénat uniforme
Idéal pour les tissus mous
Grande étendue de volume
Coûteux
Possibilité de lyser les cellules sans briser les organelles
Attention à la chaleur (travail sur glace)
Quelles sont les caractéristiques de l’homogénéisateur de type Dounce et Potter-Elvehjem?
Piston ajusté dans un tube de verre
Surtout utilisé pour les cellules eucaryotes et les tissus mous
Adaptés pour les faibles volumes
Idéal pour lyser les cellules sans briser les organelles
Ne convient pas aux bactéries et levures avec parois rigides
Quelles sont les caractéristiques de l’homogénéisateur à billes (bead beater)?
Surtout pour cellules en suspension et faibles volumes
Efficace pour briser les cellules difficiles à lyser (bactéries, levures)
Souvent combiné avec des méthodes chimiques
Attention à la chaleur
Quelles sont les caractéristiques de l’homogénéisateur à haute pression?
Très efficace pour briser les cellules difficiles à lyser (bactéries, levures)
Non adapté pour les grands volumes
Appareil dispendieux
Limité aux suspensions de cellules
Sensible aux agglomérats
Quelles sont les caractéristiques de la sonication?
Ultrasons créant des forces de cavitation (qui font exploser la cellule)
Attention à la chaleur
Très efficace pour briser les cellules difficiles à lyser (bactéries, levures)
Limité aux suspensions de cellules
Homogénat très uniforme
Brise les organites cellulaires
Peut fragmenter l’ADN
Quelles sont les méthodes d’extraction enzymatiques?
Traitements enzymatiques pour briser la MEC des tissus
Traitements enzymatiques pour fragiliser les parois
Quelles sont les caractéristiques du traitements enzymatiques pour briser la MEC des tissus?
Enzymes comme la collagénase, trypsine, pectinase, etc.
Très pratique pour isoler des cellules intactes
Pré-traitement dans un tampon adapté
Parfois combinée à d’autres techniques pour lyse complète des cellules
Quelles sont les caractéristiques du traitements enzymatiques pour fragiliser les parois?
Pour les cellules difficiles à lyser
Lysosyme, symolyase, cellulase, etc.
Pré-traitement dans un tampon adapté
Souvent combiné avec lyse douce
Quelles sont les méthodes d’extraction chimiques?
Choc osmotique
Utilisation de détergents
Utilisation d’agents chaotropiques
Quelles sont les caractéristique du choc osmotique?
Pour cellules animales
Solution hypotonique : cytolyse
Solution hypertonique : plasmolyse
Quelles sont les caractéristiques de l’utilisation de détergents?
Composé amphiphile (amphipatique)
S’incorporent dans les membranes, qu’ils fragilisent et finissent par briser
Quels sont les types de détergents qui peuvent être utilisés?
Ionique (fort, dénaturant et moussant)
Non-ionique (faible, non dénaturant, non moussant)
Quelles sont les caractéristiques des agents chaotropiques?
Déstabilisent les interactions hydrophobes et les ponts H, dénaturant les protéines
Très pratique pour extraire des protéines insolubles
Dénaturation des acides nucléiques
Quels sont quelques exemples d’agents chaotropiques?
Urée
Phénol-chloroforme
Quel sont les composantes du tampon de lyse?
Travail sur glace
Utilisation de réactifs RNase-free/DNase-free
Utilisation d’inhibiteur de protéases
Ajout d’agents réducteurs
Quelles sont les techniques de purification les plus communes?
Dialyse
Filtration
Centrifugation
Précipitation
Chromatographie
Électrophorèse
Quels sont les principes physico-chimique de la dialyse?
2 compartiments séparés par une membrane semi-perméable
Diffusion de solutés grâce à un gradient de concentration
Plusieurs porosités disponibles
Méthode simple, mais lente
Quelles sont les utilisations de la dialyse?
Dessalage
Retrait de contaminants
Concentration de protéines
Modification de pH
Quelles sont les caractéristiques de la filtration?
Utilisation de filtres avec une porosité de grande taille
Basse pression
Principalement utilisée pour retirer les débris cellulaires, les bactéries et les résidus solides
Étape souvent effectuée après l’extraction et avant la purification
Quelles sont les caractéristiques de l’ultrafiltration?
Utilisation de filtres avec une porosité de très petite taille
Haute pression
Principalement utilisée pour concentrer les macromolécules, éliminer les petites molécules ou changer le tampon
Méthode simple et rapide
Plus adaptée aux petits volumes
Quels sont les principes de la centrifugation?
Une particule est soumise à une force quand le tube est tourné à une certaine vitesse
Force de centrifugation (F=masse effectivevitesse angulaire^2rayon)
Comment est exprimer la vitesse de centrifugation?
En RPM (révolution par minute)
Comment est exprimée la force de centrifugation relative (RCF)?
En g, soit le nombre de fois de l’accélération gravitationnelle terrestre
Qu’est-ce que la sédimentation?
La résistance du milieu au déplacement de la particule constitue une force de flottaison qui s’oppose à la sédimentation de la particule
Quel est le résultat si la particule est plus dense que le milieu?
Grande vitesse de sédimentation
Quel est le résultat si le milieu est plus dense que la particule?
Petite vitesse de sédimentation
Quels sont les aspects qui ont un impact sur la sédimentation?
La masse
La densité
La forme
Quels sont les différents types de rotors des centrifugeuses?
Rotor à angle fixe (garde le même angle)
Rotor à godets oscillants (commencent à la vertical pour finir à l’horizontal)
Quels sont les types de centrifugation?
Centrifugation différentielle
Centrifugation sur gradient de densité
Quelles sont les caractéristiques de la centrifugation différentielle?
Permet de séparer +/- grossièrement les constituants cellulaires selon leur vitesse de sédimentation
Séparation ou fractionnement d’un homogénat selon la masse, la densité et la forme
Surtout utilisée pour la récupération de culots et l’obtention de préparation partiellement pures d’organelles et de macromolécules
Comment se fait une centrifugation différentielle?
On procède à une série de centrifugation avec des forces centrifuges croissantes
Quelles sont les caractéristiques de la centrifugation sur gradient de densité?
Souvent combinée à la centrifugation différentielle
Méthode la plus utilisée pour la séparation des organelles et des macromolécules
Comment se fait une centrifugation sur gradient de densité?
On dépose notre échantillon sur une certaine solution possédant un gradient de densité discontinu ou continu et on centrifuge à une seule vitesse
Quelles sont les deux catégories de centrifugation sur gradient de densité?
Centrifugation isopycnique
Centrifugation zonale sur gradient
Quelles sont les caractéristiques de la centrifugation isopycnique?
Séparation selon la densité des particules
Densité des particules doit être entre les limites du gradient
Centrifugation à l’équilibre
Masse impacte seulement la vitesse de sédimentation vers la position d’équilibre
Quels sont les types de génération du gradient de densité?
Généré d’avance
Autogénéré
Comment fait-on le gradient de densité généré d’avance?
Déposer l’échantillon au-dessus du gradient déjà formé
Comment fait-on le gradient de densité autogénéré?
Mélanger l’échantillon avec la solution gradient
Quelles sont les caractéristiques de la centrifugation zonale sur gradient de densité?
Utilisée pour séparer des particules avec des densités similaires
Séparation selon la taille (plus lourdes au fond)
Densité de la particule plus grande que la densité la plus élevée du gradient
Pas de centrifugation à l’équilibre
Qu’est-ce que la précipitation?
Réduction de la solubilité des molécules via altérations avec le solvant
Formation d’un précipité sous forme d’agrégats en solution
Quels sont les facteurs qui permettent la précipitation?
Changement de pH
Sels
Ajout de solvants
Température
Autres
Vrai ou Faux : La sédimentation est accélérée par la centrifugation
Vrai
Quel est le principe de la précipitation des protéines au sulfate d’ammonium?
La modification de la force ionique de la solution permet de précipiter plus ou moins rapidement les protéines
Qu’est-ce que le maintien de la solubilité (salting-in)?
À faible concentration, les ions neutralisent les charges ioniques en surface
Qu’est-ce que la sortie de la solution (salting-out)?
À forte concentration, les ions compétitionnent pour les molécules d’eau
Comment fonctionne la précipitation à l’éthanol/isopropanol?
Neutralisation des charges négatives des phosphates par des ions positifs
Séquestration des molécules d’eau et augmentation des interactions avec les sels grâce aux alcools
Perte de la charge et de la conformation et sortie de solution
Quelle est la définition de la chromatographie?
Ensemble de méthodes qui assurent la séparation des constituants d’un mélange en utilisant deux phases non miscibles
Quelles sont les deux phases non miscibles dans la chromatographie?
Phase stationnaire : immobile, choisie pour sa grande affinité pour les divers solutés
Phase mobile : entraîne les divers solutés le long de la phase stationnaire
Sur quel principe repose la séparation des constituants lors de la chromatographie?
L’affinité des substances pour la phase stationnaire
(Grande affinité = migration lente)
(Petite affinité = migration rapide)
Quelles sont les caractéristiques des molécules que l’affinité influence?
La solubilité différentielle dans chaque phase
L’adsorption et désorption sur la phase stationnaire
Qu’est-ce que l’absorption?
Internalisation des molécules
Qu’est-ce que l’adsorption?
Affinité des molécules avec la surface
Quels sont les types de classification des chromatographies?
Selon l’état des phases
Selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire
Selon le principe des interactions entre les solutés et la phase stationnaire
Selon les modalité de migration de la phase mobile
Quelles sont les caractéristiques de la classification selon l’état des phases?
C’est l’état de la phase mobile qui détermine le nom de la chromatographie
(Ex.: Chromatographie en phase liquide a une phase mobile liquide)
Quels sont les types de chromatographie selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire?
Chromatographie de surface (étendue sur une surface plane)
Chromatographie sur colonne (à l’intérieur d’une colonne)
Quels sont les types de chromatographie selon le principe des interactions entre les solutés et la phase stationnaire?
Adsoption
Partage
Échange d’ions
Filtration sur gel
Affinité
Interactions hydrophobes
Chélation
Qu’est-ce qu’une chromatographie d’adsorption?
Liaisons de faibles énergies assurant la fixation des solutés à la phase stationnaire
Qu’est-ce qu’une chromatographie de partage?
Solubilisation différentielle des solutés entre phases mobile et stationnaire liquides
Qu’est-ce qu’une chromatographie d’échange d’ions?
Liaisons ioniques entre les charges du soluté et de la phase stationnaire
Qu’est-ce qu’une chromatographie par filtration sur gel?
Diffusion/exclusion des solutés dans une phase stationnaire solide
Qu’est-ce qu’une chromatographie d’affinité?
Interactions biospécifiques entre les solutés et la phase stationnaire porteuse d’un ligand
Qu’est-ce qu’une chromatographie d’interactions hydrophobes?
Liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et les solutés
Qu’est-ce qu’une chromatographie de chélation?
Liaisons entre un métal divalent et les solutés porteurs de doublets d’électrons libres
Quels sont les types de chromatographie selon les modalités de migration de la phase mobile?
Chromatographie par élution
Chromatographie par déplacement
Quelles sont les caractéristiques de la chromatographie par élution?
Surtout utilisé en colonne
Sortie des solutés de la phase stationnaire grâce à un éluant ajouté à la phase mobile
Variation brusque ou continue de la concentration/composition de l’éluant
Brise les interactions solutés/phase stationnaires
Quelles sont les caractéristiques de la chromatographie par déplacement?
Surtout utilisé sur surface
Maintien des solutés dans la phase stationnaire
Révélation des solutés présents dans la phase stationnaire par coloration
Quelles sont les caractéristiques de la chromatographie sur couche mince?
Chromatographie en phase liquide
Phase stationnaire fixée sur plaque généralement polaire (gel de silice)
Phase mobile qui migre par capillarité, moins polaire
Rétention des solutés dans la phase stationnaire par adsorption des forces électrostatiques
Quel est le calcul du rapport frontal pour chaque composé séparé dans une CCM?
Rf=d(soluté)/D(solvant)
(Rf faible = très polaire)
(Rf élevé = peu polaire)
Quelles sont les applications de la chromatographie sur couche mince?
Permet un contrôle facile et rapide de la pureté d’un composé organique
Très utile pour rechercher le meilleur solvant avant d’entreprendre une séparation par chromatographie sur colonne
Quels sont les types de révélation pour la chromatographie sur couche mince?
Directe
Indirecte
Qu’est-ce que la révélation directe dans la chromatographie sur couche mince?
Pour les substances naturellement colorées (possible de suivre la progression)
Qu’est-ce que la révélation indirecte dans la chromatographie sur couche mince?
Utilisation des UV (230-365 nm) ou de révélateurs chimiques, parfois les deux
Quel est le principe de la chromatographie sur papier?
Les échantillons hydrophobes vont monter plus rapidement par capillarité sur le papier en raison d’un solvant aqueux
Quels sont les types de chromatographie sur colonne?
Filtration sur gel
Affinité
Hydrophobe
Échanges d’ions
Qu’est-ce que la chromatographie par filtration sur gel?
Méthode de séparation basée selon la taille des solutés et qui utilise un tamis moléculaire
De quoi est composé la phase stationnaire en chromatographie par filtration sur gel?
De microbilles poreuses
Comment se fait la séparation dans une chromatographie par filtration sur gel?
Séparation basée sur la capacité des différentes molécules à diffuser dans les pores
Aucune liaison moléculaire entre le soluté et la phase stationnaire
Quelles sont les premières particules qui vont être éluées dans une chromatographie par filtration sur gel?
Les plus grosses particules sont éluées en premier, alors que les plus petites sont retenues plus longtemps
Que signifie une étendue de la capacité de fractionnement étroite dans une chromatographie par filtration sur gel?
Que la séparation entre les molécules de tailles similaires est très efficace
Quel est le type d’éluant utilisé dans la chromatographie par filtration sur gel et pourquoi?
Élution avec un tampon non dénaturant et de composition fixe pour conserver les complexes protéiques
Qu’est-ce que le coefficient de partage dans la chromatographie par filtration sur gel?
Le soluté est distribué entre l’eau interne et l’eau externe
Quel est le calcul du Kav (coefficient de partage)?
Kav = (Vélution - Vmort) / (Vtotal - Vmort)
Que signifie un Kav de 0?
Que le soluté est totalement exclu
Que signifie un Kav > 0, mais < 1?
Que le soluté est partiellement inclus
Que signifie un Kav = 1?
Que le soluté est totalement inclus
Que signifie un Kav > 1?
Que le soluté est inclus et adsorbé
Quel est le principe de la chromatographie d’affinité?
Interaction spécifique entre deux molécules
Le soluté à séparer se fixe réversiblement à un ligand spécifique attaché à une matrice insoluble
Quel est le mécanisme de la chromatographie d’affinité?
Le soluté est adsorbé spécifiquement à la colonne
Lavages
Le soluté est désorbé de la colonne
Quels sont les conditions à respecter pour une chromatographie d’affinité?
Conditions non-dénaturantes pour conserver les structures fonctionnelles, étant donné que la chromatographie repose sur des interactions structures dépendantes
Quels sont les types d’élution utilisé?
Gradient de pH ou force ionique croissante
Gradient de ligand avec plus forte affinité (compétition)
Quelles sont les spécificités de la chromatographie d’affinité?
Nécessite une connaissance préliminaire de la structure et de la spécificité biologique du composé à purifier
Utilisation d’étiquettes protéiques qui vont se lier à la phase stationnaire
Qu’est-ce que l’IMAC?
Une chromatographie d’affinité qui utilise l’affinité entre une protéine et un atome métallique
Quelles sont les caractéristiques de l’IMAC?
Résine populaire : Ni-NTA
Utilisation d’étiquette 6xHis-tag
Élution : imidazole
Attention : EDTA/AGTA qui chélate les ions métallique
Quel est le principe de la chromatographie d’interactions hydrophobes?
Séparation selon le degré d’hydrophobicité des composants
Comment est la phase stationnaire dans une chromatographie d’interactions hydrophobes?
Résine portant des groupements hydrophobes, souvent des chaînes de carbone saturées
Comment est la phase mobile dans une chromatographie d’interactions hydrophobes?
Tampon avec gradient de concentration en sels (+ vers -)
Le sels favorisent les interactions hydrophobes en masquent les interactions électrostatiques et en compétitionnent pour les molécules d’eau
Quel est le mécanisme de la chromatographie d’interactions hydrophobes?
On force les parties hydrophobes des protéines à s’exposer avec le sel
Plus une protéine est hydrophobe, moins elle a besoin de sels pour interagir
Les protéines les plus hydrophobes sortent en dernier
Que est le principe de la chromatographie échangeuse d’ions?
Séparation selon la charge nette des composés
Comment est la phase stationnaire dans la chromatographie échangeuse d’ions?
Composée de groupes fonctionnels chargés négativement ou positivement
Quel est le mécanisme de la chromatographie échangeuse d’ions?
Adsorption des solutés par liaisons ioniques et déplacement des contre-ions
Qu’est-ce qu’une colonne échangeuse de cations?
Groupement négatif
Contre-ion échangeable positif
Qu’est-ce qu’une colonne échangeuse d’anions?
Groupement positif
Contre-ion échangeable négatif
Vrai ou Faux : Les composés de même charge ou de charge neutre ne sont pas adsorbés sur la phase stationnaire dans la chromatographie échangeuse d’ions
Vrai
Quels sont les types d’élution dans la chromatographie échangeuse d’ions?
Augmentation de la concentration en sels
Changement dans le pH de la phase mobile
Comment le sel agit-il dans la chromatographie échangeuse d’ions?
Compétitionne pour la phase stationnaire
Neutralise les charges des composés et des protéines
Comment le pH agit-il dans la chromatographie échangeuse d’ions?
Change la charge nette des composés et des protéines (charge des groupements fonctionnels)
Qu’est-ce que le point isoélectrique?
pH auquel la charge nette d’une molécule est nulle
Si le pH est plus haut que le pI, que se produit-il?
La molécule est déprotonée et devient négative
Si le pH est plus bas que le pI, que se produit-il?
La molécule est protonée et devient positive
Qu’est-ce que la chromatographie liquide haute performance?
Même principe que la chromatographie sur colonne classique, mais utilisation de système sophistiqué haute performance
Quels sont les avantages de la chromatographie liquide haute performance?
Fortes pressions
Séparation rapide
Haute résolution
Détection en temps réel possible
Avec quels types de chromatographie la chromatographie liquide haute performance est-elle compatible?
Chromatographie d’exclusion
Chromatographie d’affinité
Chromatographie d’échange d’ions
Chromatographie de partage
Quel est l’appareillage de la chromatographie liquide haute performance?
Injecteur (entre 10 et 100 μl)
Pompe (entre 5 000 - 7 000 psi)
Colonne (longueur et diamètre varié)
Phase mobile : polarité, force éluante, etc.
Détecteur : UV, IR, électrochimie, etc.
Élution : mode isocratique ou gradient
Vrai ou Faux : Dans une chromatographie liquide haute performance, plus le temps d’élution est court, meilleure est la résolution
Faux
Quelles sont les caractéristiques du détecteur UV dans la chromatographie liquide haute performance?
Mesure l’absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne
Sensibilité de l’ordre du ng
Détection seulement si le produit absorbe à une longueur d’onde accessible à l’appareil
Quantitatif (loi de Beer-Lambert)
Polyvalent, mais peu spécifique
La phase mobile ne doit pas absorber la lumière à la longueur d’onde choisie
Quelles sont les caractéristiques du détecteur fluorimètre dans la chromatographie liquide haute performance?
Mesure de la fluorescence émise
Plus sélectif et sensible que UV (fg)
L’intensité de la fluorescence est directement proportionnel à la concentration
Quel est l’inconvénient du détecteur fluorimètre dans la chromatographie liquide haute performance?
Peu de composés sont naturellement fluorescents, il faut donc ajouter des étiquette fluorescentes
Quelles sont les caractéristiques du détecteur réfractomètre dans la chromatographie liquide haute performance?
Mesure la variation de l’indice de réfraction à la sortie de la colonne
Extrêmement précis, mais peu sensible (μg)
Comparaison de l’indice avec celui de la phase mobile pure
Utilisation en mode isocratique seulement
Sensible aux variations de température
Quelles sont les caractéristiques du détecteur électrochimique dans la chromatographie liquide haute performance?
Mesure le changement de courant électrique produit par la réduction ou l’oxydation d’une substance à une électrode
Limité aux substances oxydables ou réductibles
Très grande sensibilité (fg)
Méthode destructive
Quelles sont les caractéristiques de la spectrométrie de masse dans la chromatographie liquide haute performance?
Largement utilisé, surtout en protéomique
Idéal pour les mélanges complexes et composés inconnus
Détermine la composition, la structure et la masse moléculaire des solutés
Grande sensibilité (ng/pg)
Méthode puissante, mais coûteuse
Méthode destructive (composés ionisés)
Quelles sont les caractéristiques de la chromatographie en phase gazeuse?
Applicable à des échantillons gazeux ou susceptibles d’être vaporisés
Phase mobile gazeuse
Phase stationnaire liquide ou solide
Différents types de détecteur possibles
Quel est le principe de la chromatographie en phase gazeuse?
Séparation selon la solubilité/adsorption avec la phase stationnaire
Séparation selon le point d’ébullition
Quel est le principe général de l’électrophorèse?
Séparation des molécules grâce à un champ électrique
Par quoi la mobilité des molécules est-elle influencée dans l’électrophorèse?
Taille
Charge
Forme
Puissance du champ
Force ionique
pH du tampon
Support ou matrice utilisée pour la séparation
Quels sont les types d’électrophorèses possibles?
Électrophorèse horizontale (gel d’agarose)
Électrophorèse verticale (gel de polyacrylamide)
Quelles sont les caractéristiques de l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Principalement utilisée pour la séparation des acides nucléiques (ADN)
Séparation principalement selon la taille des molécules
Analytique ou pour purification
Quelles sont les grandes étapes de l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Préparation du gel d’agarose
Dépôt des échantillons
Migration
Révélation
Qu’est-ce que la préparation du gel d’agarose dans l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Chauffage et refroidissement de l’agarose qui forme naturellement une matrice organisée via la formation de ponts H entre les chaînes de polymères
Coulage dans un moule adapté à la cuve d’électrophorèse
Installation du peigne avec le nombre de puits et volume variables
Qu’est-ce que l’agarose?
Forme purifiée de l’agar contenant seulement de l’agarobinose, un polymère linéaire très long
Quelle est l’importance de la concentration d’agarose dans la préparation du gel d’agarose pour l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Plus la concentration est élevée, plus le treillis aura une fine porosité et sera plus efficace pour séparer les petites molécules
Vrai ou Faux : Les solubilisé d’agarose sont toujours préparés dans de la saline
Faux
Qu’est-ce que le dépôt des échantillons dans l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Mélange des échantillons avec une solution de chargement de densité élevée
Présence de colorant pour le suivi de la migration
Avec ou sans SDS et EDTA
Dans le dépôt des échantillons pour l’électrophorèse sur gel d’agarose, quelle est l’utilité du SDS?
Dénaturation, linéarisation et uniformisation des charges des protéines
Dans le dépôt des échantillons pour l’électrophorèse sur gel d’agarose, quelle est l’utilité du EDTA?
Arrêt de la réaction enzymatique
Dans le dépôt des échantillons pour l’électrophorèse sur gel d’agarose, quelle est l’utilité de la solution de chargement?
Permet de faire tomber l’échantillon au fond du puit et qu’il ne se répande pas dans le tampon, car c’est une matière très visqueuse
Qu’est-ce que la migration dans l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Les tampons utilisé sont TAE et TBE, qui sont les solutions électrolytiques
pH à 8 pour donner une charge négative aux acides nucléiques
Utilisation de blocs d’alimentation spécialisés 80 - 120V
Voltage entre
Quels sont les avantages et désavantages d’appliquer un voltage élevé dans la migration pour l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Avantage : migration rapide
Désavantage : peut dissoudre le gel d’agarose à cause de la chaleur
Quels sont les avantages et désavantages d’appliquer un voltage bas dans la migration pour l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Avantage : séparation très claire et nette
Désavantage : migration très longue
Quel est le principe de la migration dans l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Les petites molécules migrent plus rapidement, les plus grosses plus lentement
Qu’est-ce que la révélation dans l’électrophorèse sur gel d’agarose?
Utilisation de colorants qui ont une affinité pour les acides nucléiques
Coloration avant ou après la migration
Classiquement agents intercalants ± toxiques
Utilisation de standards de fragments de masses moléculaires connues
Pourquoi est-ce important de linéarisé l’ADN avec de faire une électrophorèse sur gel d’agarose?
L’ADN linéarisée migre à sa taille attendue, alors que l’ADN non linéarisé surestime la taille de l’ADN
Quels sont les autres types d’électrophorèse pour les acides nucléiques?
Électrophorèse haut-débit en capillaires
Électrophorèse en champ pulsé (PFGE)
Qu’est-ce que l’électrophorèse en champ pulsé (PFGE)?
Séparation des grosses molécules dans un gel d’agarose avec une alternance des champs électriques pour permettre aux molécules de se faufiler entre les fibres du gel d’agarose
Quelles sont les caractéristiques de l’électrophorèse sur gel d’acrylamide?
Utilisé pour la séparation des protéines
Condition dénaturantes (SDS-PAGE) ou non-dénaturante
Surtout analytique (purification MS)
Quelles sont les grandes étapes de l’électrophorèse sur gel d’acrylamide?
Préparation du gel de polyacrylamide
Dépôt des échantillons
Migration
Révélation
Qu’est-ce que l’électrophorèse SDS-PAGE dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide?
La plus utilisée avec les protéines
Permet d’uniformiser les formes et les charges des protéines pour les séparer uniquement selon leur taille
Quel est le rôle du SDS dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide SDS-PAGE?
Le SDS est un composé amphiphile qui se lie aux acides aminés, déplie la protéine et lui donne une charge négative uniforme
Quel est le rôle du B-mercaptoéthanol dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide SDS-PAGE?
Le B-mercaptoéthanol permet de briser le pont disulfure pour séparer les sous-unités protéiques les unes des autres
Dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide SDS-PAGE, quelles sont les molécules qui sortent en premier?
Les petites molécules sont les premières à sortir, alors que les plus grosses molécules sont les dernières à sortir
Qu’est-ce que la préparation du gel de polyacrylamide dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide?
Polymérisation du gel avec des catalyseurs pour favoriser la formation de la matrice
Polymérisation verticale pour limiter les échanges avec l’air ambiant
Plus la concentration en acrylamide est élevée, plus le treillis sera serré
Qu’est-ce que le dépôt des échantillons dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide?
Solution de chargement 10-20% glycérol
Colorant pour le suivi de la migration
2-4% SDS
B-mercaptoéthanol ou DTT
Chauffer pour dénaturer et rendre moins visqueux
Qu’est-ce que la migration dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide?
Utilisation de deux gels superposés : gel concentrateur et gel séparateur
Qu’est-ce que le gel concentration dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide?
Permet à toutes les protéines du puit d’arriver en même temps grâce à la glycine et au pH = 6.8
Qu’est-ce que le gel séparateur dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide?
pH = 8.8, la glycine migre très vite et ne fait plus blocage
Les protéines commencent à migrer toutes en même temps
Qu’est-ce que la révélation dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide?
Coloration au bleu de Coomassie
Simple, rapide et sensible (5-25 ng)
Condition acide : acides aminés aromatiques et basiques
Surtout pour vérifier présence de protéines
Compatible avec la spectrométrie de masse
Qu’est-ce que l’immunobuvardage de type WESTERN?
Utilisation d’anticorps spécifiques contre la protéine d’intérêt à révéler
Quel est le principe de l’immunobuvardage de type WESTERN?
Faire un sandwich pour transférer les bandes du gel sur une membrane de nitrocellulose (coté positif)
Quel type de coloration est utilisée pour vérifier le transfert lors d’un immunobuvardage de type WESTERN?
Coloration au Ponceau S (liens faibles facilement réversibles)
Qu’est-ce que la détection via des anticorps spécifiques dans l’immunobuvardage de type WESTERN?
Anticorps secondaire couplé à une molécule chimiluminescente qui reconnaît la chaîne lourde de l’anticorps primaire et s’y lie
Qu’est-ce que l’électrofocalisation?
Séparation selon le pI des protéines
Quelles sont les caractéristiques de l’électrofocalisation?
Utilisation d’un gel de polyacylamide avec gradient de pH stable
Migration jusqu’à l’attente du pI
Très sensible
Pas de SDS, puisqu’on veut séparer selon la charge naturelle
Qu’est-ce qu’un gel 2D dans l’électrofocalisation?
Axe x : séparation selon pH/pI
Axe y : séparation selon poids moléculaire en condition SDS-PAGE
Vrai ou Faux : Plus les ondes sont courtes, plus le rayonnement à de l’énergie
Vrai
Qu’est-ce que la spectrophotométrie?
Méthode analytique qui mesure l’absorption de la lumière par une substance
Chaque molécule présente un spectre d’absorption unique
Quel est le principe de la spectrophotométrie?
Lorsque la lumière passe à travers une solution, une partie est absorbée
L’intensité de la lumière transmise sera inférieure à la lumière initialement transmise
Qu’est-ce que la loi de Beer-Lambert?
L’absorbance est proportionnelle à la concentration d’une espèce en solution
A = coefficient d’extinction molaire * longueur du trajet optique * concentration de l’espèce absorbante
Qu’est-ce qui arrive si la solution est trop concentrée?
Le signal est saturé et tombe dans une zone non linéaire de la courbe standard
Quel est le schéma général d’un spectrophotomètre?
Source polychromatique
Monochromateur (sépare la lumière polychromatique et ne laisse passer que la longueur d’onde voulue)
Diaphragme
Cuve (contient l’échantillon)
Cellule photoélectrique
Amplificateur
Afficheur
Quelles sont les utilisations courantes en biologie de la spectrophotométrie?
Mesure de la concentration cellulaire
Dosage des acides nucléiques
Dosage des protéines
Quelles sont les caractéristique de la mesure de la concentration cellulaires par spectrophotométrie?
Surtout pour les microorganismes
La lumière est déviée plutôt qu’absorbée
Mesure de la turbidité ou de la densité optique
La densité optique est proportionnelle à la concentration cellulaire en solution
Mesure à 600 nm
Quels sont les avantages et désavantages de la mesure de la concentration cellulaires par spectrophotométrie?
Avantages : Simple, rapide, faible coût, méthode non destructive
Désavantage : technique très dépendante de la sensibilité de l’appareil, ne différencie pas les cellules mortes des cellules vivantes
Qu’est-ce que le suivi de la croissance microbienne par spectrophotométrie?
Permet un suivi en temps réel
Utilisation du lecteur de plaque
Que faire si les cellules sont trop petites pour bien obstruer le faisceau lumineux?
Suivi de l’acidification du milieu via l’utilisation de colorant comme le rouge de Phénol
Plus il y a de cellules, plus le milieu est acide
Qu’est-ce que le dosage des protéines par spectrophotométrie?
Les protéines absorbent fortement entre 200 - 400 nm
Absorption via les liens doubles
Quelles sont les caractéristiques du dosage des protéines par spectrophotométrie?
Absorption à 280 n couramment utilisée
Proportionnelle à la concentration protéique en solution
Biais selon la quantité d’acides aminées aromatiques dans la protéine
Utilisation d’une courbe standard de la protéine purifiée pour être quantitatif
Comment obtenir une meilleure sensibilité dans le dosage des protéines par spectrophotométrie?
Utilisation de colorants spécifiques comme le bleu de Coomassie dans la méthode de Bradford, qui se lie principalement aux acides aminés basiques et aromatiques en conditions acides
Quels sont les avantages de la méthode de Bradford?
Sensibilité d’environ 0,1 μg/ml vs 100 μg/ml
Spécificité accrue
Biais d’absorption moins grand
Courbe standard nécessaire pour la quantification précise
Qu’est-ce que le dosage des acides nucléiques par spectrophotométrie?
Absorbance à 260 nm via les doubles liens des bases azotées
Estimation de la concentration en utilisant des valeurs de coefficient d’extinction molaire approximatif
Sensible 1-2 ng/μl
Quel est le problème avec le dosage des acides nucléiques par spectrophotométrie?
Interférence importante des protéines à 260 nm
Le ration A260/A280 indique le degré de pureté de l’ADN/ARN
Qu’est-ce que la fluorescence?
Processus dans lequel des atomes sont excitées par l’absorption d’un rayonnement électromagnétique et reviennent à leur état d’énergie initial en libérant l’excès d’énergie sous forme de photon
Quelles sont les différences entre la fluorescence et la phosphorescence?
Fluorescence : Émission de lumière quasi instantanée qui s’arrête lorsqu’on retire la source d’excitation
Phosphorescence : Émission de lumière à retardement qui peux continuer des heures après l’arrêt de l’excitation
Vrai ou Faux : Les photons émis sont toujours de plus grande énergie que les photons d’excitation, donc de longueur d’onde plus faible
Faux
Qu’est-ce que la fluorimétrie?
Utilisation de la capacité de certaines molécules de fluorescer afin de détecter ou quantifier des composés d’intérêt
Pourquoi est-ce que la fluorescence est plus spécifique que l’absorbance?
Parce qu’en fluorimétrie, les contaminants doivent avoir les mêmes systèmes d’absorption et de réémission que la molécule d’intérêt, alors qu’en spectrophotométrie, ils doivent seulement avoir le même système d’absorption
Quel est l’appareil qui mesure la fluorescence?
Spectrofluorimètre
Est-ce que la loi de Beer-Lambert s’applique en fluorimétrie?
Elle s’applique en utilisant l’émission, plutôt que l’absorbance
Quels sont les facteurs qui influence l’absorption et la fluorescence?
pH
Température
Présence de solvants, tampon ou autres molécules contaminantes (blanc)
Concentration trop élevée ou trop basse
Quels sont les exemples d’application de la fluorimétrie?
Visualisation de l’ADN
Quantification des acides nucléiques à l’aide de colorants spécialisés
Quantification des protéines
Détection de protéines fluorescentes
À quoi servent les protéines fluorescentes?
Fusion protéique pour déterminer la localisation cellulaire, mesurer le niveau d’expression et faire le suivi de populations microbiennes
Qu’est-ce que la luminescence?
Terme générique qui englobe tous les types d’émission de lumière froide (sans production de chaleur) par excitation d’atomes ou de molécules
Qu’est-ce que la chimiluminescence?
Émission de lumière suite à une réaction chimique
Quelles sont les applications de la chimiluminescence?
Immunobuvardage de type WESTERN
Mesure de l’expression des gènes
Marquage de types cellulaires via expression de la luciférase
Quel est l’appareil de détection de la chimiluminescence?
Luminomètre optimisé pour la détection de la lumière dans une chambre étanche et avec une haute sensibilité
Qu’est-ce que la bioluminescence?
Chimioluminescence produite par un organisme vivant
Qu’est-ce que l’immunologie?
Étude du système immunitaire, grâce à la distinction entre le soi et le non-soi
Qu’est-ce qu’un anticorps?
Complexe protéique produit par le système immunitaire adaptatif en réponse à la présence d’un antigène
Quelles sont les actions des anticorps?
Reconnaissance spécifique des antigènes
Neutralisation des agents pathogènes
Qu’est-ce qu’un antigène?
Substance, naturelle ou synthétique, généralement étrangère qui est reconnue par les anticorps et à la capacité de provoquer une réaction immunitaire
Quelle est la composition d’un anticorps (humain)?
Structure en Y de 2 chaînes lourdes identiques et 2 chaînes légères identiques lia par des ponts disulfures
Une région variable sur chacun des bras pour lier l’antigène
Une région constante pour lier les cellules immunitaires
Quelle est la principale classe d’anticorps utilisée dans les techniques immunologiques?
IgG
Qu’est-ce que le paratope?
Région de 5-10 acides aminés qui est responsable de la reconnaissance moléculaire des anticorps (régions variables)
Qu’est-ce que épitope?
Région de 5-6 acides aminés présente sur les antigènes et qui est reconnue par les paratopes (CDR)
Que se passe-t-il lorsqu’un paratope lie un épitope?
Formation d’un complexe anticorps-antigène
Pourquoi la sensibilité des essais immunologiques est-elle si élevée?
L’affinité d’un anticorps pour son antigène est très élevée
Il y a liaison Ac-Ag même à des concentrations très faibles
Qu’est-ce qu’un épitope séquentiel?
Séquence continue et contiguë d’acides aminés reconnus
Qu’est-ce qu’un épitope conformationnel?
Acides aminés non contigu, mais retrouvé très près les uns des autres dans la conformation naturelle de la protéine
Que sont les anticorps polyclonaux?
Reconnaissance de différents épitopes, car les clones viennent de différents lymphocytes B et ont différents paratopes
Que sont les anticorps monoclonaux?
Issus de l’hybridation entre un lymphocyte B et un myélome pour former un hybridome qui produit des anticorps avec un paratope unique pour la reconnaissance d’un seul épitope
Quelles sont les différences de sensibilité entre les anticorps polyclonaux et monoclonaux?
Polyclonaux : Plus grande sensibilité pour la détection de faibles quantités d’antigènes, spécificité moindre
Monoclonaux : Spécificité très élevée, moins de chances de réactivité croisée
Par quelle technique se fait la purification d’anticorps?
Par chromatographie d’affinité avec une matrice d’antigène
Quelle est la cible de l’anticorp secondaire dans l’immunobuvardage de type WESTERN?
La chaîne constante de l’anticorps primaire
Quelle est la première étape à réaliser lors d’un Western Blot, avant l’utilisation d’anticorps?
Utilisation d’un colorant facilement réversible pour vérifier que le transfert des protéines a bien été réalisé
Dans la technique du Western Blot, comment se fait le blocage de la membrane et pourquoi est-il important?
Application de protéines inertes pour éviter que les anticorps ne lie la membrane de manière non spécifique
Quelle est la particularité des lavages lors du Western Blot?
Lavage avec des solutions contenant un peu de sels ou de détergent pour défaire les liens non spécifiques
Quelle est la séquence de l’immunobuvardage de type WESTERN?
Vérification du transfert
Lavage
Blocage de la membrane
Incubation avec l’anticorps primaire
Lavage
Incubation avec l’anticorps secondaire
Lavage
Révélation
Qu’est-ce qu’il est possible de mesurer avec l’immunobuvardage de type WESTERN?
Variable qualitative
Variable semi-quantitative (présence en plus grande quantité dans un échantillon traité que dans un échantillon non traité)
Quels sont les problèmes courants lors d’un Western Blot?
Absence de bandes
Bandes de mauvaises masses moléculaires
Bruit de fond élevé
Qu’est-ce qui peut causer une absence de bande lors du Western Blot?
Trop basse expression de l’antigène
Mauvaise localisation cellulaire
Incompatibilité entre anticorps secondaire et primaire
Épitope conformationnel
Qu’est-ce qui peut causer des bandes de mauvaises masses moléculaires lors du Western Blot?
Dégradation par des protéases
Modification post-traductionnelles
Dénaturation insuffisante
Qu’est-ce qui peut causer un bruit de fond élevé lors du Western Blot?
Concentration trop élevée de l’anticorps primaire
Blocage/lavage insuffisant
Réactivité croisée avec d’autre antigènes
Qu’est-ce que la technique ELISA?
Essai en plaque conçu pour détecter et quantifier des anticorps ou des antigènes
Quels sont les avantages de la technique ELISA?
Rapide
Simple
Sensible
Haut-débit
Quelle est la principale utilité de la méthode ELISA?
Diagnostic des infections
Détection des allergènes
Quelles sont les variantes de la technique ELISA?
ELISA direct
ELISA indirect
ELISA sandwich
Quelles sont les caractéristique de l’ELISA direct?
Variante la plus simple et la plus rapide
L’anticorps sélectionné doit être conjugué à un système de détection
Bruit de fond parfois plus important en raison de l’immobilisation non-spécifique de l’antigène
Quel est le mécanisme de l’ELISA direct?
Fixation de l’antigène
Lavage + blocage
Anticorps primaire
Lavage + blocage
Mesure du signal
Quelles sont les caractéristique de l’ELISA indirect?
Utilisation d’un anticorps primaire et un anticorps secondaire
Plus grande flexibilité que l’ELISA direct, mais un peu plus long
Meilleure sensibilité, car liaison de plus d’un anticorps secondaire par anticorps primaire
Immobilisation non-spécifique de l’antigène (bruit de fond)
Quel est le mécanisme de l’ELISA indirect?
Fixation de l’antigène
Lavage + blocage
Anticorps primaire
Lavage + blocage
Anticorps secondaire
Lavage + blocage
Mesure du signal
Quelles sont les caractéristique de l’ELISA sandwich?
Capture spécifique de l’antigène via l’anticorps primaire immobilisé à la surface des puits
Anticorps secondaire qui reconnait un épitope distinct
Parfait pour détecter les antigènes dans les mélanges complexes
Détection directe ou indirecte
Quel est le mécanisme de l’ELISA sandwich?
Anticorps primaire
Lavage + blocage
Capture de l’antigène
Lavage + blocage
Anticorps secondaire
Lavage + blocage
(Possibilité d’un anticorps tertiaire
Lavage + blocage)
Mesure du signal
Quel est le mécanisme de l’immunoprécipitation?
- Ajout de l’anticorps au mélange
- Formation du complexe Ac-Ag
- Ajout de billes volumineuses liant le fragment Fc
- Centrifugation douce, retrait du surnageant, lavage
- Élution, centrifugation finale, récupération du surnageant
Dans la technique d’immunoprécipitation, quelles sont les types de billes volumineuses qui peuvent être utilisés?
Billes d’agarose
Billes magnétique
Qu’est-ce que la réaction d’agglutination?
Antigène à la surface de particules qui provoque la formation d’agrégat
Quelle est la condition qui doit être respectée pour que la réaction d’agglutination ait lieu?
L’équilibre entre la quantité d’antigène et d’anticorps doit être optimal (zone d’équivalence)
Quelle est l’application principale de l’hémagglutination?
Identification des groupes sanguins (ABO)
Que sont les anticorps recombinants?
Variantes des anticorps naturels :
Fragments synthétiques (seulement une portion de la chaîne lourde de l’anticorps)
Chimère (hybridation d’anticorps de différentes espèces)
Multivalence (reconnaissance de 3 ou 4 antigènes à la fois)
Qu’est-ce que le phage display?
Utilisation de plasmide de phage injecté dans des bactéries et contenant des séquence d’une librairie d’anticorps
Les phages sont testés avec un antigène et seulement ceux qui réagissent sont conservé et amplifier
Permet la création de nouveaux anticorps
