Principer för rekombinant DNA-teknik och introduktion till DNA-sekvensering Flashcards
Vad är en rekombinant DNA-molekyl?
En molekyl med DNA som kommer från olika källor (ofta olika arter).
Vad innebär DNA-kloning?
Att skapa identiska kopior av ett DNA (t.ex. en gen) genom att sätta in det i en bärarmolekyl som sedan får kopieras av en värdorganism.
Plasmider
- små cirkulära molekyler med dubbelsträngat DNA som kan utnyttjas för DNA-kloning
- kallas även ”kloningsvektorer” eller ”expressionsvektorer”
- används av bakterier för att utbyta genetisk information
- kan bära på främmande DNA-fragment och transportera in det i celler
Ligaser
Enzymer som ”klistrar ihop” DNA
Restriktionsenzymer
Enzymer som ”klipper sönder” DNA
Hur kan man använda sig av bakterier för att kopiera en DNA-molekyl?
- DNA ”klistras in” i en plasmid mha. DNA-ligas —> rekombinant DNA-molekyl
- plasmiden ”stoppas in” i bakterier (ofta E. Coli)
- när bakterierna odlas och förökar sig kopieras även den främmande plasmiden
- stora mängder av plasmiden kan isoleras från bakteriekulturen
Uttryck av ett rekombinant protein från en klonad gen
• ofta är ett första steg att den bärare (ofta plasmid) som bär på genen kopieras
• för att få expression av ett rekombinant protein krävs:
- levande celler som kan utföra expression
-egenskaper hos bärarmolekylen som möjliggör expression, t.ex. en promotor anpassad för värdcellen
Vad är skillnaden mellan en dideoxynukleotid och en deoxynukleotid?
En dideoxynukleotid skiljer sig från en deoxynukleotid på så sätt att -OH-gruppen i 3’-positionen är ersatt av en väteatom.
Varför förhindras ytterligare elongering av kedjan när en dideoxynukleotid sätts in i en DNA-kedja?
En dideoxynukleotid som sätts in i DNA-kedjan blockerar ytterligare elongering eftersom dideoxynukleotiden saknar den 3’-OH-grupp som behövs för att kunna bilda en bindning med nästa nukleotid.
Kedjeterminering
- Man använder enkelsträngat DNA som mall och låter ett DNA-polymeras bygga på nukleotider i en komplementär kedja.
- Förutom vanliga nukleotider lägger man till dideoxynukleotider: ett slags ”falska” nukleotider som – ifall de sätts in i kedjan – stoppar fortsatt DNA-syntes.
- Slumpvis insättning av vanliga och ”falska” nukleotider ger olika långa DNA-molekyler som alla har en dideoxynukleotid i änden.
- Dideoxynukleotiderna är märkta med olika flourescerande färg och när de olika långa DNA-molekylerna separeras efter storlek så kan DNA-kedjan ”läsas”.
