Prática 1 Flashcards
O que é um gene reporter e suas aplicações?
Gene cujo produtos são facilmente detetados ou monitorizados e, assim, o gene serve para marcar outro gene ou DNA de interesse para várias aplicações. Pode ser utilizado para:
- identificar se um gene foi recolhido por uma célula
- quantificar a expressão genética
Sequência de SD (rbs) no mRNA:
AGGAGGU
Codões de iniciação:
AUG (maioritariamente) GUC
Codões STOP:
UAA
UAG
UGA
Reação de X-Gal e B-galactosidase:
X-gal é clivada pela B-galactosidase levando a galactose e 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol que é depois oxidado em 5,5’-dibromo-4,4’-dicloto-indigo, um produto azul insolúvel
Reação de ONPG e B-galactosidase:
Hidrólise
Conclusão em relação ao promotores pela parte B:
Os resultados de IQB405 são semelhantes a IQB300 mas mais calros, o que mostra que abf2 é regulada da mesma forma que araA, mas que é aparentemente mais fraco nas condições experimentais
Na parte C, para que meios olharias para comparar a força dos promotores?
Olhar para as estirpes IQB300 e IQB305 para os meios com arabinose - ordens de grandeza superiores em IQB300 → araA mais forte
Na parte C, para que meios olharias para confirmar que araR é repressor?
Comparar IQB300 e IQB327 s/açucar → ausência de araR leva a um aumento das U.M, logo é repressor
Na parte C, para que meios olharias para estudar a repressão pela glucose?
- IQB300 e IQB405 e comparar os meios com apenas arabinose e com arabinose + glucose → diminuição de U.M em arabinose + glucose, logo glucose é repressor
- Observa-se a repressão catabólica mesmo nas estirpes sem araR, logo podemos deduzir que a repressão por glucose é independente deste.
- A repressão catabólica é sempre maior quando o gene araR está presente (comparar índice de repressão da glucose em 327 e 300 e entre 406 e 405, sendo maior em 300 e 405) → parece haver alguma relação entre os dois fenómenos, embora sejam independentes.
Na parte C, para que valores olharias para comparar a força da repressão por glucose entre os promotores diferentes?
Índice de repressão pela glucose é superior em abf2, pelo que sofre uma maior repressão pela mesma (mecanismo de CcpA - a sequência de ligação nos 2 é diferente o que pode justificar a diferença)
Na parte C, para que valores olharias para comparar a força de regulação por araR entre os promotores diferentes?
Dividir U.M dos meio s/açucar de 327 pelas de 300 (e o mesmo entre 406/405) → ratio entre 327/300 superior do que 406/405 → repressão é superior em araA do que em abf2
O que pode explicar a diferença na regulação em araA e abf2?
Ou é o sítio de ligação de araR em abf2 que é menos eficaz ou a sequência.
Em B-subtilis onde se localiza preferencialmente a maquinaria de uptake do DNA?
Nos polos da célula
Como se dá o assembly do pillin?
Proteínas tipo pré-pillin (ComGC, ComGD, ComGE, Com GG) que estão inicialmente integradas na membrana, são processadas pela peptidase C, provocando a sua translocação para o exterior da membrana. As subunidades ligam-se e formam o Y pillin competente grande o suficiente (40 a 100 subunidades) para atravessar a parede celular de peptidoglicanos
