Práctica 8 Flashcards
Aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la biología molecular:
- identificación de agentes patógenos verificando la presencia o ausencia de su material genético
- diagnóstico de polimorfismos o mutaciones (enfermedades)
- medicina forense
- pruebas de paternidad
¿Quién desarrollo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)?
KARY MULLIS 1985
¿Qué es la PCR?
Herramienta molecular altamente sensible que puede amplificar selectivamente, esto es, producir cantidades exponencialmente grandes de una secuencia específica de ADN a partir de trazas o cantidades muy pequeñas de material genético denominado plantilla o molde de ADN
¿Dónde encontramos material genético/ADN?
- gota de sangre
- folículo piloso
- célula de la mejilla
- trozo de hueso
- semen
- saliva
¿Qué se ocupa para realizar PCR?
Una única hebra intacta de ADN molde, que puede ser cualquier forma de ADN doble cadena que se encuentre presente en una mezcla compleja de moléculas de ADN sin purificación previa
Componentes de la reacción de PCR:
- Buffer de reacción que mantiene un pH de 8 y contiene MgCl2 como cofactor enzimático.
- dNTPs (A,G,T,C) para incorporarse a las nuevas cadenas de ADN.
- ADN polimerasa termoestable para sintetizar las nuevas cadenas de ADN.
- 2 oligonucleótidos (cebadores o primers) de ADN
- ADN molde en cantidades diminutas que contiene la secuencia blanco que se desea amplificar
¿Función de los 2 oligonucleótidos en la PCR?
Flanquean y delimitan la región que será amplificada sirviendo cada uno como punto de partida para la polimerización de cada una de las cadenas complementarias. Reconocen e hibridan / unen específicamente una secuencia complementaria del ADN dentro de un genoma completo.
¿Qué es la amplificación por PCR?
Replicación o copia del material genético que se lleva a cabo bajo 3 principios moleculares, los cuales conforman en su conjunto un ciclo de PCR
¿Cuáles son los principios moleculares de la PCR?
- DESNATURALIZACIÓN del ADN doble cadena para generar cadenas sencillas lo cual se consigue incrementando la temperatura
- ALINEAMIENTO (hibridación/unión) de los primers a la secuencia especifica en el ADN molde
- EXTENSIÓN o síntesis por acción de la ADN polimerasa
Después de 35 ciclos de reacción habrá…
2^35 moléculas de ADN a partir de una sola
Temperatura en la que se lleva a cabo la desnaturalización:
94
Temperatura en la que se lleva a cabo el alineamiento/hibridación:
52
Temperatura en la que se lleva a cabo la extensión:
72
Características del termociclador:
Posee un bloque de aluminio en donde se colocan los tubos de reacción para que sean rápidamente calentados, enfriados y/o mantenidos a diferentes temperaturas por periodos programables de tiempo a través de un número determinado de ciclos de reacción
Al finalizar el número de ciclos programados de reacción, las muestras son mantenidas por el equipo a baja temperatura:
4° C, para detener la reacción y permitir que enseguida sean analizados los productos de reacción
Genoma humano:
3,500 millones de pares de bases
99.9% idéntico entre los individuos
Regiones loci:
No controlan ningún rasgo conocido ni tienen funciones conocidas
¿Qué son los loci (plural)?
Son direcciones o ubicaciones genéticas
¿Qué es un locus (singular)?
Puede tener diferentes formas (alelos) o tipos
Un locus puede ser bi - alélico (2 formas diferentes) o polimórfico (muchas formas diferentes)
Verdadero
Función de las secuencias polimórficas:
Determinan la huella genética mediante el uso de métodos genéticos moleculares
¿Qué es la huella genética?
Es el genotipo de una muestra individual de ADN
¿Qué es el genotipo?
-Secuencia de ADN en una ubicación específica, es decir un locus, en el genoma
-Conjunto particular de variaciones genéticas (polimorfismos) o alelos
¿Qué es el genotipo de cada persona?
Es su propio código de barras genético personal y único
Si las huellas genéticas obtenidas de 2 muestras biológicas coinciden, se asume:
Que dichas muestras biológicas proceden del mismo individuo o de gemelos homocigotos
¿Qué es un gemelo homocigoto?
Ocurre cuando un sólo óvulo es fertilizado por un solo espermatozoide, el cigoto resultante se divide en 2 muy temprano en el desarrollo, lo que lleva a la formación de 2 embriones separados con información genética idéntica
¿Qué son las secuencias polimórficas de ADN empleadas para la determinación de la huella genética?
Son regiones no codificantes que contienen segmentos de repeticiones cortas en tándem o STR (Short Tándem Repeats) localizadas en distintos cromosomas
¿Dónde se encuentra el locus TH01?
Cromosoma 11
- Se han descubierto más de 20 alelos en personas de todo el mundo
- Cada uno contiene un número diferente de repeticiones (TCAT)
Cada persona tiene 2 alelos: mamá y papá
Verdadero
¿Cómo se determina la huella genética?
Analizando muchos loci para mejorar el poder de discriminación de las pruebas
¿Qué es el poder de discriminación?
Capacidad del análisis de la huella genética para distinguir la diferencia genética entre diferentes individuos
- Cuánto mayor sea el número de loci analizados, más poderosa será la capacidad de discriminación
La determinación de la huella genética requiere la amplificación de las huellas polimórficas mediante la PCR utilizando primers/cebadores específicos para las secuencias que flanquean el locus STR:
Verdadero
En la reacción se sintetizan miles de millones de copias de cada uno de los 2 alelos STR originales en el ADN de cualquier persona. Estás copias contienen la misma cantidad de repetidos presentes en las copias de ADN originales:
Verdadero
En está práctica se realiza la amplificación por PCR en un solo locus, cuál:
BXP007
