PCR Flashcards
¿Qué significa las siglas PCR?
Reacción en Cadena Polimerasa
¿En qué proceso se basa la PCR?
En la replicación.
¿Qué se requiere para realizar una PCR?
Tener:
- La secuencia de DNA
- Los primers
- La enzima DNA polimerasa = Taq polimerasa
- Desoxirribonucleótidos ( dNTP )
- Cofactores = Cloruro de Magnesio ( MgCl2)
- Amortiguador/buffer: pH adecuado 8.4
Máquina utilizada para hacer la PCR:
Termociclador
¿Cuál es la única DNA polimerasa que puede utilizarse para la PCR, y por qué?
La Taq polimerasa
Porque es la única que aguanta los 95ºC necesarios para realizar la PCR.
¿De qué bacteria es extraída la Taq polimerasa?
Thermophilus aquaticus
¿Cómo son los desoxiribonucleotidos que se necesitan para la PCR?
dNTP: nucleótidos trifosfatados dATP dCTP dGTP dTTP
Los iniciadores/primers son creados por nosotros : V o F
Verdad
Función de los primers en una PCR:
Se utilizan para reconocer secuencias blanco en el DNA molde
¿Cuáles son los primers que se diseñan?
Forward 5’ a 3’
Reverse 3’ a 5’
Deben de tener alto contenido en G y C para que sean más estables.
¿Qué significa desnaturalizar en DNA?
Romper los puentes de Hidrógeno y separar las dos hebras.
¿Cuál es el primer paso?
Desnaturalizar el DNA
¿Cuál es la temperatura de la desnaturalización?
¿Cuánto tiempo dura la desnaturalización?
95ºC de 20 a 30 seg.
¿Cómo se calcula la temperatura de alineamiento (Tm)?
Se suman las G + C de los primers y lo que salga se múltiplica por 4
Se suman las A + T de los primers y lo que salga se multiplica por 2
El resultado de las dos operaciones se suman.
¿Cuáles son las fases de la PCR?
Desnaturalización
Hibridación o Alineación
Extensión
¿Qué sucede en la Hibridación o Alineación?
Los primers se unen / alinean a la cadena
¿Cuál es el rango de Tm de la Hibridación / Alineamiento?
50ºC a 60ºC
¿Qué sucede en la extensión?
La Taq polimerasa agrega los dNTP complementarios para crear cadenas completas.
¿Cuál es la temperatura de Extensión?
72ºC
Después de la PCR se realiza un …
Gel de electroforesis
¿Cómo debe ser el manejo / cambio de la temperatura?
De manera paulatina = no con brusquedad, ya que se puede romper el DNA
Al realizar varios ciclos de la PCR, se van obteniendo copias de DNA de manera…
Exponencial = 2, 4, 8, 16 …
¿Cuál es la PCR Estándar / Punto final?
Sólo detecta o amplifica un segmento Es cualitativa ( sí o no)
PCR Múltiplex
Amplifica de 2 o más segmentos de DNA
Detección Cualitativa ( sí o no).
PCR-RFLP (de enzimas de restricción )
Detecta polimorfismos genéticos (SNPs).
RT-PCR (Transcriptasa reversa)
Es a partir de un RNA se forma un DNA y luego se hace la PCR
Sirve para buscar el RNA de un virus
PCR Tiempo real
Detecta un sólo segmento
Es cuantitativa = muestra la carga total de lo que se está buscando.
¿Después de qué tipo de PCR es necesario realizar una electroforesis?
PCR punto final
¿Qué es la electroforesis?
Es una técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico.
¿Cuál es la PCR más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos?
PCR en tiempo real ( qPCR)
¿Qué se utiliza en las PCR tiempo real para cuantificar?
Fluorescencia.
Tipos de fluorescencia para la qPCR
Específicos: secuencia complementaria a la que estamos buscando, unida a un floróforo y a un inhibidor (sondas).
No específico (SYBER Green): se une a cualquier Cadena de DNA doble.
¿Cuáles son los dos tipos de cuantificación de la qPCR?
Absoluta y Relativa
¿Cómo es la cuantificación Absoluta?
Conoce el número exacto de copias amplificadas del blanco.
¿Cómo es la cuantificación Relativa?
Evalúa los cambios en la expresión de genes .
Se compara el resultado obtenido con uno basal.
