DNA recombinante- Enzimas De Restricción Flashcards
¿Cuáles son las tres formas de reproducción parasexual bacteriano?
- Transformación
- Conjugación
- Transducción
Reproducción parasexual bacteriano TRANSFORMACIÓN:
La célula receptora capta del medio extracelular, ADN libre procedente de otra célula y lo acopla al suyo.
Reproducción parasexual bacteriano CONJUGACIÓN:
Se realiza contacto físico entre la célula donante y la receptora a través de Pilis ( puente) y le transfiere un plásmido.
Reproducción parasexual bacteriano TRANSDUCCIÓN:
Los bacteriófagos insertan de su DNA en la bacteria, el cual empieza a reproducir todo el genoma del fago, luego libera todos los bacteriófagos que produjo y así se vuelven a pegar a otra bacteria.
Los biotecnólogos utilizan DNA recombinante para :
Producir productos de : Diagnóstico, Prevención o Tratamiento.
Proceso para realizar un DNA Recombinante:
- Identificar el gen que se desea transferir.
- Aislar el gen utilizando enzimas de restricción que cortan al DNA.
- Cortar un pedazo del vector con las mismas enzimas de restricción.
- Ligar el gen con el vector mediante ligasas (enlaces fosfodiéster).
- El DNA recombinado se introduce en la célula huésped.
- Se confirma que la célula huésped tiene las propiedades del ADN transferido.
- Se clona el gen, dejando que se multipliquen las células huésped.
Características de las Enzimas de Restricción:
- Son endonucleasas ( cortan el DNA a la mitad).
- Son mecanismos de defensa de las bacterias frente a la entrada de DNA foráneo ( degradan el DNA extraño).
- Metilan el DNA cromosómico de la bacteria ( así sólo degradan DNA que no esté metilado).
- Cortan enlaces fosfodiéster.
- Reconocen secuencias palindrómicas.
- Son producidas por bacterias.
¿Qué es una secuencia palindrómica?
Es una secuencia de nucleótidos que se leen igual de los dos lados:
5’ AATTCGAATT 3’
3’ TTAAGCTTAA 5’
¿Cuál es la enzima de restricción que más se utiliza?
La EcoRi
¿Cuáles son los tipos de corte del DNA?
Cohesivo
Romos
Corte Cohesivo:
- Cortes en diferentes posiciones/ disparejos
- Deja nucleótidos libres
Corte Romos:
- Cortes simétricos en ambas cadenas.
- No deja nucleótidos libres.
¿Qué tipo de corte de ADN es mejor para hacer DNA Recombinante?
Corte cohesivo.
¿Qué es un vector?
Es una molécula de DNA doble que puede albergar un fragmento de DNA extra / exógeno.
¿Cuáles son los plásmidos (vectores) de CLONACIÓN y qué partes lo conforman?
- Se utilizan principalmente para estudios.
- De ellos se obtienen grandes cantidades de DNA
CARACTERÍSTICAS
- Ori: sitio de origen de la replicación.
- SMC: sitio múltiple de clonación
( secuencias palindrómicas)
lugar donde las enzimas de restricción lo reconocen. - Amp: Marcador de selección
Nosotros lo escogemos para que tenga una característica específica : Ex: resista a antibióticos.
¿Cuáles son los plásmidos ( vectores) de EXPRESIÓN y qué partes lo conforman?
- Son para producir un transcrito RNA y/o proteínas (un producto) Ex: insulina.
- Se puede utilizar plásmidos o bacteriófagos.
CARACTERÍSTICAS:
- Ori : origen de replicación
- CMV : promotor
- IRES: sitio de entrada / reconocimiento de ribosomas
- SMV: sitio múltiple de clonación
- PoliA: cola de poli AAA
- Amp: marcador de selección
¿Cuáles son los tipos de vectores que se pueden utilizar para un ADN Recombinante?
Plásmidos Bacteriófagos Cósmidos Fragémidos Cromosomas artificiales
¿De qué depende qué se utilice un vector u otro?
Dependiendo del tamaño de la secuencia de pares de bases que queremos introducir.
¿Qué es un plásmido?
Es el DNA de las bacterias que no es vital y le dan propiedades nuevas a la bacteria.
- Doble cadena
- Circular
- Separado del DNA cromosómico
- Presente en bacterias y levaduras
- Se le pueden introducir hasta 15,000 pb.
¿Qué es un bacteriófago?
- Son virus que infectan a las bacterias y les insertan su DNA.
- Nosotros los modificamos genéticamente eliminando los genes para que se repliquen o empaqueten.
- Se le pueden introducir hasta 23,000 pb
¿Qué es un cósmido?
- Son vectores híbridos: DNA de plásmido + DNA de bacteriófago.
- Se elimina su capacidad de reproducción y empaquetamiento.
- Es más grande: se puede introducir hasta 45,000 pb.
¿Qué es un fagémido?
- Es DNA lineal
- Plásmido al que se le incorpora el Ori (origen de replicación) de un Bacteriófago .
- No tiene sitio de empaquetamiento (COS).
- Se le pueden introducir hasta 45,000 pb.
¿Qué son los cromosomas artificiales?
- Es ADN Cromosómico modificado de bacterias (BAC) o levaduras (YAC) para usarse como vectores.
- Se le pueden introducir hasta 45,000 pb.
¿Qué son las Nucelasas Programambles?
-Son como enzimas de restricción, pero del cuerpo humano.
-Enzimas modificadas genéticamente para reconocer secuencias específicas de DNA ds .
- Tienen dos monomeros:
Uno para Identificar la secuencia
Otro para cortar la secuencia
-Son para corregir y editar defectos genéticos.
Enzimas de restricción tipo 1:
- Reconocen secuencias cortas de 6 a 7 pares de bases (pb).
- El sitio de corte es lejos del sitio de reconocimiento.
- El sitio de corte es aleatorio: río abajo o río arriba ( no se sabe).
Enzimas de restricción tipo 2:
- Estas son las que se utilizan en los laboratorios.
- Reconocen secuencias cortas de 4 a 8 pares de bases.
- El sitio de reconocimiento es igual al sitio del corte.
- Es específica.
Enzimas de restricción tipo 3:
- 2 secuencias de reconocimiento.
- Corte asimétrico / aleatorio.
- Corte lejos de la secuencia de reconocimiento ( 20 a 30 pb ).
Enzimas de restricción tipo 4:
Cortan el DNA metilado de la propia bacteria.
En el laboratorio ¿qué se utiliza para hacer más porosa a la bacteria, para que su membrana sea más permeable y acepte el vector?
Glicerol 10%
Ca Cl2
