PCR Flashcards
Cos’è la PCR?
Tecnica in vitro per amplificare una regione di DNA compresa tra due regioni a sequenza nota
Come verifico che la PCR è andata a buon fine?
Gel detection, elettroforesi su gel di agarosio
reazione PCR
Semplifica ciò che avviene in vivo durante la replicazione: 3 passaggi con 1 DNApol
Avviene in volume ridotto (50 microlitri)
Condizione necessaria è conoscere le sequenze DNA della zona primer, lo si può fare solo con DNA lineare ma non con DNA circolare
Ingredienti base:
-acqua
- DNA stampo o RNA (serve produrre cDNA con trascrittasi inversa RTPCR)
-2 primers di DNA (non RNA come in vivo) sintetizzati da sintetizzatori automatici
-DNApol termostabile
-buffer per tamponare acidificazione dovuta all’aggiunta dei nucleotidi (liberato 1H+ ogni dNTP aggiunto)
-Mg per attivare dnapol
Primer forward si appaia al filamento antisenso 5’-3’, primer reverse si appaia al filamento senso 3’-5’; la DNApol si appaia all’estremità 3’ del primer e amplifica i 2 filamenti contestualmente (duplicazione sincrona e semiconservativa) come se fossero entrambi veloci.
Preparata la miscela di reazione viene inserita in un termociclatore: un blocco peltier con forellini in cui posizione le provette, capace di modificare la temperatura in aumento o diminuzione in maniera rapida grazie a passaggio di corrente.
Ciclo di PCR è composto da 3 tappe, una reazione completa prevede massimo 40 cicli (=2 ore)
1. Denaturazione D avviene a 95°C, metodo reversibile, più grande è la sequenza di DNA più è alta la temperatura ma se la temperatura supera i 95°C tutto il DNA è denaturato ma viene denaturata anche la DNApol con i primer
2. Ibridazione annealing A abbassa la temp a 55°C per favorire il corretto appaiamento dei primer, se la temperatura è più alta non si appaiano perché vengono denaturati, se è più bassa può avvenire un appaiamento non corretto generando sottoprodotti, la temperatura di A vincola il risultato di PCR
3. Elongazione E extension aumentata la temp a 72°C per far lavorare la DNApol, durata proporzionale alla lunghezza della seq di DNA da amplificare.
La resa di tutta la reazione di PCR è 85%
Per verificare i prodotti alla fine della reazione si fa gel detection con elettroforesi su gel di agarosio
Perché non si va oltre il 40° ciclo?
Tra il 30 e 40 esimo ciclo si è in fase di plateau.
Dal punto di vista teorico la PCR ha una resa del 100% e segue un andamento esponenziale 2^n, in pratica la resa media calcolata sarà dell’85% con andamento 2^n-2n
Fasi della PCR:
- esponenziale efficienza 100%
- lineare, i composti si consumano e la reazione rallenta
- paletau, la reazione si ferma e i prodotti di PCR si iniziano a degradare (FINE)
Costituenti della reazione di PCR
DNA: anche degradato e vecchio, da una goccia di sangue scaldato a 100°C e centrifugato
Enzima DNA pol
Mullis usò DNA pol 1 ma si denaturava e andava raggiunta
Introdotta metodica di enzimi termoresistenti come Taq pol estratta dal microrganismo estremofilo
Tutte le pol ricombinanti sono tutte resistenti ad alte temperature
Emivita aumenta ad esempio con la deep vent
Si distinguono anche per la processività
Nucleotidi conc. Variabile, non creare disequilibri, stessa probabilità di trovare una delle 4 basi, si mette in eccesso per evitare che manchi substrato
Primers: non si devono formare strutture secondarie o appaiamenti tra i primers; lunghezza dipende anche dalla temperatura Tm alla quale si deve appaiare al DNA, creare primer di lunghezza per avere una T di appaiamento tra 55-70°C
Si assegnano 2°C per ogni A e T (2 legami a idrogeno), 4 °C per ogni G e C (3 legami a idrogeno)
Si calcola Tm= (numero A+T)×2 + (numero G+C)×4
Limiti della PCR
Taq non ha attività proof reading, quindi PCR introduce errori casuali problemi nel clonaggio dei prodotti
RT PCR cosa è?
Variante della PCR in cui uso invece della polimerasi uso trascrittasi inversa che permette di amplificare a partire dal segmento di mRNA, sintetizzato cDNA.
Segue 1 ciclo di PCR con Taq pol e usa 1 solo primer
Tool diagnostico per infezioni virali es.HIV
Applicazioni della PCR
Rilevazione anomalie trascritti (mRNA) limite richiede mRNA tessuto in cui è espresso
Diagnostica malattie genetiche, infezioni, cancro, distingue omo (omoduplex) e eterozigoti (eteroduplex)
Rilevazione mutazioni puntiformi con ASPCR
ASPCR
Allele specific oligonucleotide PCR
Applicazione della PCR per la rilevazione di mutazioni puntiformi
Si può applicare solo se conosco la sequenza mutata, il problema si supera con il sequenziamento del gene.
Si discrimina la seq wild type da quella mutata tramite un primer specifico: stesso primer reverse ma differente primer forward uno wild type e uno che presenta la mutazione.
Primer forward mutato si appaia correttamente con la seq nucleotidica mutata, DNA pol si lega a 3’ e amplifica.
Il primer wild type non si appaia correttamente e non avviene l’amplificazione.
Gel detection su gel di agarosio: se si ha l’amplificazione solo dove uso il primer con la mutazione ma non dove ho usato wild type, il paziente è omozigote con 2 alleli mutati;
Se si ha amplificazione solo quando si usa il primer wild type, il paziente è sano (omozigosi); se si amplifica sia dove ho usato il primer mutato sia dove ho usato il primer wild type il paziente è eterozigote con 1 allele mutato e 1 allele senza mutazione.
Sequenziamento del DNA
Metodo di Sanger
Sfrutta la capacita della DNA pol di aggiungere un nucleotide all’OH in 3’: OH in 3’ attacca il fosfato alfa rilasciando pirofosfato e creando un legame fosfodiestereo con il nuovo nucleotide.
Se non c’è OH in 3’ la reazione non avviene.
Sanger introduce nella reazione didesossinucleotidi o terminatori di catena, privi dell’ossidrile anche in 2’
Quando viene aggiunto alla catena blocca il processo della polimerasi che si stacca.
Procedimento per il sequenziamento di un frammento di DNA
Componenti:
- DNA stampo
- primer
- DNA pol
- 4 nucleotidi
- 1 didesossinucleotide
Preparate 4 reazioni di PCR
Miscela separata in 4 frazioni per ogni base nucleotidica a cui si aggiunge il didesossinuckeotide corrispondente in rapporto definito perché se ne mettiamo troppi si creano frammenti molto corti.
Si formano frammenti di lunghezza variabile
I didesossinucleotidi venivano marcati con fosforo radioattivo
Separazione su gel PAGE per la risoluzione elevata
Limitazioni: molto lungo, 4 reazioni, grandi quantità di PAGE, radioisotopi
Metodo sanger automatizzato: 4 fluorocromi diversi legati ai didesossinucleotidi così da non usare 4 reazioni separate.
Si utilizza elettroforesi capillare
Lettura corsa elettroforetica con laser che eccita i fluorocromi rilevati da detector, si ottiene elettroferogramma
Come si può quantificare il DNA?
Con la PCR non si può poiché il prodotto finale è variabile in funzione del numero di copie di partenza
Si utilizza la RealTime PCR
Real Time PCR
Viene monitorata la fluorescenza emessa durante la reazione di PCR
È MOLTO SENSIBILE rileva fino a una singola copia di DNA
Usata per induviduare infezione virale
la fluorescenza è proporzionale a prodotto di PCR
Ogni ciclo di PCR origina curva: si osserva un plateau dove le curve toccano un massimo simile come se la quantità di DNA iniziale fosse la stessa per tutti i campioni.
Curve si spostano a dx, la quantità di DNA è minore
Primi 18 cicli fluorescenza bassa, registrato 0, ciclo 20 fluorescenza inizia a raddoppiare
Quando quantità di DNA è maggiore si amplifica prima, si generano più ampliconi, segnale fluorescenza maggiore
Limite: la singola copia si misura al 35 ciclo
Ct ciclo di soglia o threshold: valore limite di detection proporzionale alla quantità di DNA iniziale
Tramite retta di taratura estrapolato Ct
Alto costo attrezzatura ma processo non più costoso di PCR
Quali sono i sistemi di rilevazione dell’amplicone? (Real time PCR)
2 sistemi
SYBR Green: fluoroforo intercalante, aumento della fluorescenza durante la fase di estensione, economico
TaqMan probe/hydrolysis probe technique : sonda di idrolisi coniugata con fluorocromo
Si basa su 3 primer ( forward, reverse, probe)
Probe si posiziona tra reverse e forward per avere fluorescenza
La Taq pol amplifica la seq bersaglio e idrolizza il probe; probe intatto presenta fluorocromo quencher che annulla la fluorescenza del reporter, quando avviene idrolisi si separano e la fluorescenza del fluorocromo reporter diventa rilevabile
Fluorescenza aumenta a causa dell’accumulo di fluorocromi reporter durante ogni ciclo.
Elettroforesi
Tecnica che permette di separare acidi nucleici in base alla carica e alla dimensione
Poiché gli avidi nucleici hanno tutti la stessa carica negativa si separano in base alla forma e alla dimensione
Elettroforesi su PAGE
Gel di poliacrilammide
Alta risoluzione riesce a separare frammenti che differiscono per poche basi ma separa frammenti non molto grandi
