Clonaggio Flashcards
Cosa è il clonaggio?
Tecnica che permette di inserire un frammento di DNA esogeno tramite un vettore appropriato all’interno di una cellula per far propagare tale frammento per ottenere una copia identica e far produrre alla cellula il metabolita scelto
Sfrutta la capacità del primer di avere in 5’ sequenze non complementari al filamento stampo dette siti di restrizione, sono seq palindrome riconosciute dagli enzimi di restrizione batterici che li tagliano
Enzimi di restrizione batterica sono stati sviluppati contro i fagi e distinguono il DNA batterico da quello virale grazie alla presenza di siti di metilazione su A e C
Metilazione importante negli eucarioti perché nel DNA le zone metilate non sono trascritte;
Esistono 3 tipi di enzimi di restrizione:
1. Primo tipo: dopo il riconoscimento della sequenza, taglia tra mille e 5000 paia di basi dopo il sito di riconoscimento
2. Secondo tipo: dopo il riconoscimento della sequenza, il taglio avviene a livello di questa sequenza
3. Terzo tipo: dopo il riconoscimento della sequenza, taglia 20-30 paia di basi oltre il sito di riconoscimento
Il taglio può avvenire in diversi modi:
- taglio a estremità sporgenti (o coesive): questo può avvenire sulla porzione 3’ oppure sulla porzione 5’. taglia filamento senso e filamento non senso su due nucleotidi diversi
- taglio a estremità piatte (o blunts): è un taglio netto verticale, che taglia sulla stessa coppia di nucleotidi sia il filamento senso sia il filamento non senso.
Per alcuni enzimi la specificità non è assoluta
Due enzimi che riconoscono la stessa sequenza sono detti ISOSCHIZOMERI (riconoscono la stessa sequenza ma la tagliano in maniera diversa)
Vettori
sistema capace di trasportare sequenze di DNA di interesse all’interno di un organismo estraneo e permettere l’espressione dei geni o l’integrazione degli stessi nell’organismo target.
vettori possono essere di due tipi:
- Vettori di clonaggio
- Vettori di espressione
Caratteristiche minime: replicazione autonoma, selezionabilità
Composti da moduli discreti che conferiscono varie caratteristiche ad esempio la resistenza all’ampicillina
I più comuni sono basati su plasmidi o sul batteriofago lambda.
Differenza vettori di clonaggio e vettori di espressione
I vettori di clonaggio servono ad amplificare un determinato frammento di DNA all’interno di una popolazione (tipicamente Escherichia Coli)
E’ la contropare “in vivo” della PCR, che è un processo “in vitro”
I vettori di espressioni invece, come dice il nome stesso, vengono utilizzati per far “esprimere” un gene che codifica una proteina di rilievo.
Cosa differenzia il vettore plasmidico da quello di espressione?
La differenza tra plasmidi e vettori di espressione risiede nel fatto che i vettori di espressione presentano un promotore molto forte.
Vettori plasmidici
Plasmidi
La sottofamiglia di vettori più utilizzati
Elementi extra-cromosomici circolari a doppio filamento che si replicano con la cellula ospite.
Tanto più piccolo è il plasmide, tanto più è stabile.
Spesso contengono geni di resistenza agli antibiotici, siti di restrizione o modificazione
I plasmidi possono essere:
- Plasmidi rilassati : numero elevato di copie;
- Plasmidi stringenti : basso numero di copie
Entrambi si replicano grazie al macchinario dell’ospite. Se la proteina che vogliamo esprimere è tossica, usiamo uno stringente. Se non è tossica usiamo un rilassato.
I plasmidi utilizzati in laboratorio sono sintetici.
Plasmide pBR322
Primo plasmide costruito sulla base dei plasmidi batterici
Contiene:
- una origine della replicazione (ori) specie-specifica sempre presente,
- 2 marcatori di selezione: gene che codifica per la resistenza all’ampicillina AMPR e gene che codifica per la resistenza alla tetraciclina TETR
- un gene di controllo della replicazione (rop)
- molti siti di clonaggio
- 3 Siti di restrizione: Siti unici di taglio (PstI, EcoRI, BamHI)
plasmide digerito da enzima effettua un unico taglio e linearizza il vettore
obiettivo: utilizzare pBR22 per veicolare un inserto.
primer che ho utilizzato nella PCR hanno inserito alle estremità del frammento le sequenze di restrizione BamHI.
se digerisco sia il plasmide sia l’inserto con l’enzima di restrizione BamHI, l’enzima taglierà e linearizzerà il plasmide, taglia anche le estremità del frammento e crea delle estremità
coesive; a incastro l’inserto avendo estremità complementari va a inserirsi nel plasmide e la ligasi va a saldare il vettore linearizzato e l’inserto.
Inserto può inserirsi in un modo o nel modo invertito.
Si sfrutta la resistenza antibiotica per isolare prima le cellule con plasmide ricombinante e casuale dalle cellule che hanno il frammento e il plasmide linearizzato.
Introdurre il plasmide nelle cellule, metto cellule su terreno contenente ampicillina: non tutte le cellule acquisiranno il plasmide e non avranno la resistenza all’ampicillina;
In questo caso il sito di restrizione BamHI è posizionato sul modulo della resistenza alla tetraciclina (la resistenza alla ampicillina è rimasta intatta).
le cellule che le cellule che hanno acquisito il plasmide ricombinante con quello casuale pBR322, trasferiscono la resistenza alla ampicillina alle altre cellule.
Dopo che si è ottenuta la piastra con le cellule (in colonne) che hanno uno dei due plasmidi, si va a fare una copia e si va a inserirlo su una piastra contenente tetraciclina.
3 possibilità di acquisizione della resistenza:
-il plasmide non è digerito
-Digerito ma richiuso su se stesso senza inserire l’inserto;
- Inserto si è inserito nel punto di taglio
Si sfrutta resistenza alla tetraciclina per distinguere i 3 casi:
Plasmide originario ha entrambe le resistenze
Se nel gene di resistenza alla tetraciclina va a posizionarsi l’inserto, la resistenza alla tetraciclina non ci sarà più quindi le cellule che acquisiscono il plasmide con l’inserto non cresceranno sul terreno con tetraciclina.
Tra le colonie copiate ne crescono solo alcune perché non sono resistenti alla tetraciclina
Posso confrontare le piastre e selezionare le copie delle colonie che non hanno più la resistenza alla tetraciclina.
Questo sistema non può essere utilizzato con EcoRI.
Plasmidi pUC
Piccolo e stabile
Solo 1 marker di resistenza all’ampicillina
Siti di restrizione accumulati MCS multi cloning site
Plasmide rilassato
Usare l’ampicillina non fa distinguere quale ha l’inserto e quale no
Viene aggiunto il gene lacZ, che codifica per la β-galattosidasi enzima dell’operone lac che codifica per gli enzimi del metabolismo del lattosio, che scinde il lattosio in galattosio e glucosio.
L’inserto si inserisce nel sito di lacZ, quindi si perde la possibilità di metabolizzare il lattosio.
Si sfrutta questa caratteristica per lo Screening blu-bianco:
Nella piastra è presente un pigmento chiamato X-gal (con struttura simile al lattosio) che è incolore quando è legato allo zucchero, e nel momento in cui viene digerita dalla β-galattosidasi diventa di colore blu che si deposita all’interno della cellula, genera due
molecole, il galattosio e pigmento che è un precipitato all’interno della cellula con il risultato che le cellule si colorano di più.
Le colonie sulle piastre così appariranno bianche o blu (nelle bianche non c’è la beta galattosidasi, contengono il plasmide con l’inserto).
Cosmidi
Plasmidi che contengono il gene cos del batteriofago lambda
Vettori di espressione
Contengono un pezzo di DNA chiamato promotore dove si lega la DNA polimerasi, collocato prima della seq codificante.
promotore inducibile forte, un sito di clonaggio multiplo per l’inserimento del gene bersaglio e uno sterminatore della trascrizione. Inoltre, può essere incluso un sito di legame al ribosoma (RBS) per rendere più efficiente la traduzione.
forza di promotore si intende la capacità del promotore di esprimere un determinato gene.
Operone
unità di trascrizione nei batteri: geni raggruppati in porzione di DNA costituito da un promotore e una serie di geni adiacenti codificanti per proteine diverse appartenenti però alla stessa via metabolica.
Operone lac
Metabolismo del lattosio
Com’è fatto l’operone lac?
Meccanismo
L’operone del lattosio, detto Lac, è così strutturato: il promotore, dove si lega RNA Polimerasi, l’operatore e sito di legame di attivazione.
Le cellule procariotiche possono utilizzare lattosio in assenza di glucosio, ma è necessario che questo sia scisso in galattosio e glucosio.
Nel metabolismo del lattosio tramite permeasi il lattosio entra in cellula, tramite uno specifico trasportatore, va incontro alla scissione da parte della beta-galattosidasi (lacZ) che lo scinde in galattosio e glucosio.
Inoltre, il lattosio può essere convertito in allolattosio, epimero del lattosio, dove cambia il legame del galattosio e glucosio non sul C5 ma sull’ossidrile in 6. L’allolattosio a sua volta viene scisso ancora in galattosio e glucosio ed ha un ruolo di regolazione metabolico prodotto
in piccole quantità.
Sistema dell’operone lac funziona posizionando in qualunque promotore del vettore di espressione la regione dell’operatore lac e fornendo, contemporaneamente il gene lacI, che codifica per il repressore del lattosio.
Espressione in E.coli
Nel terreno c’è solo glucosio (no lattosio) il gene lacI viene trascritto e sulla sequenza dell’operatore si lega il repressore che impedisce alla RNA polimerasi di procedere. Questo fa si che gli enzimi che servono al metabolismo del lattosio non vengono sintetizzati perché non viene prodotta mRNA per questi tre enzimi, beta galattosidasi(LacZ) , permeasi (LacY)e transacetilasi ( LacA).
Quando siamo in condizioni in cui nel terreno non c’è glucosio, ma lattosio, il gene LacI, costitutivo, produrrà sempre il repressore, ma nel momento in cui è presente lattosio, questo viene convertito un po’ in allolattosio che è l’effettore, cioè si va a legare al repressore, ne cambia la struttura e il repressore non si lega più all’operatore. A questo punto l’RNA polimerasi è libera di procedere ma non è sufficiente a produrre mRNA.
L’attivatore è la proteina CAP che lega cAMP e successivamente si va a legare al sito attivatore del promotore e vanad attivare RNA polimerasi. In assenza di glucosio l’adenilato ciclasi è attivata e produce cAMP che permette all’enzima di entrare in funzione.
Se nel terreno é presente sia glucosio che lattosio, sul promotore non è presente nessuna proteina di regolazione perché la presenza del lattosio, in quanto piccola, fa si che si produca allolattosio per cui il repressore viene legato da allolattosio, cambia la sua configurazione conformazionale e non si lega al DNA, ma la presenza del glucosio non fa produrre cAMP alla cellula quindi anche la proteina Cap non è legata al sito attivatore quindi RNA Polimerasi
non è stabilizzata sul promotore.
La cellula se deve scegliere preferisce consumare glucosio, quindi fin quando sono presenti entrambi : quando la cellula consuma tutto il glucosio si alzano i livello di cAMP e la proteina CAP si attiva e attiva la trascrizione.
Man mano che diminuisce il glucosio la cellula si prepara ad utilizzare lattosio e si prepara a produrre gli enzimi del metabolismo del lattosio.
preso il promotore del lattosio, inserirlo in un vettore di espressione e invece di mettere i tre geni è stato inserito il gene di nostro interesse per cui il promotore si attiva e trascrive anche il gene di nostro interesse, oltre a trascrivere i geni del lattosio.
Invece di utilizzare il lattosio che costa, si utilizza un derivato del lattosio che si chiama IPTG
( isopropil-beta-tio-D-galattoside). Svolge la stessa funzione del lattosio, quindi inibisce il repressore con la differenza che non viene metabolizzato quindi bastano piccole quantità perché non verranno consumate dalla cellula.
LacI è importante perché in alcune situazioni la proteina può risultare tossica
Il limite del promotore LacI è che non è forte quindi se voglio grosse quantità di proteina non è indicato per questi scopi. Si ricorre al sistema T7.
Vettore di espressione pET (sistema di espressione T7)
Come funziona?
Vettore di espressione che presenta il promotore della RNApol del fago T7.
non posso usarlo con tutte le cellule batteriche, ma solo sulle cellule batteriche ingegnerizzate che presentano il gene dell’RNA polimerasi del fago.
Vettore trasformato in E.coli
Gene per la RNA pol del fago messo a valle del promotore lac quindi quando IPTG stimola la trascrizione viene trascritta la RNApol T7 che si lega al promotore sul vettore di espressione.
presenza di un plasmide addizionale nelle cellule di E.Coli (pLysS)in grado di
produrre il lisozima T7 inattiva ogni RNA polimerasi T7 prodotta in assenza d’induzione.
CARATTERISTICHE DI UN VETTORE DI ESPRESSIONE EUCARIOTE
Sono vettori ‘SHUTTLE’ perché possono replicarsi in DUE differenti ORGANISMI (E. coli e per es. S. cerevisiae).
Possiedono DUE ORIGINI di replicazione e DUE MARCATORI di selezione.
Saccharomyces cerevisiae
Organismo unicellulare
Vantaggio di poter effettuare alcune modificazioni post-traduzionali.
Possibile uso di promotori costitutivi forti:
Uso del sistema inducibile GAL: l’induzione da galattosio produrrà una quantità maggiore di proteina target.
cellule di mammifero sono utilizzati i marcatori di selezione dominanti che conferiscono alla cellula un fenotipo completamente nuovo.
Si tratta di marcatori di origine batterica i cui prodotti rendono le cellule resistenti ad alcune molecole (farmaci)
Le cellule trasfettate vengono selezionate su un terreno contenente la giusta concentrazione di questo farmaco
Purificazione delle proteine
Tecnica migliore cromatografia per affinità;
due tipi:
- uno più costoso prevede di utilizzare sulla base fissa degli anticorpi che riconoscano la nostra proteina quando viene espressa è espressa con un epitopo specifico riconosciuto dall’anticorpo,
- la nostra proteina presenta un tag, cioè una porzione che si lega per affinità a qualcosa che si lega sulla base fissa e la trattiene.
ottimizzare questo sistema nella cromatografia sul nostro supporto spesso è necessario aggiungere uno spaziatore che distanzi la base fissa dal sistema di riconoscimento della proteina
Cromatografia per affinità
– legame di un braccio spaziatore alla matrice della colonna
– legame di un ligando allo spaziatore
– legame della proteina al ligando
– eluizione di tutte le impurità e proteine aspecifiche per il ligando
– eluizione della proteina dalla matrice di affinità
tag di istidina: sequenza di 6 o più His istidine al C o N terminale
in grado di chelare gli ioni metallici come il nichel presente sulla base fissa, immobilizzati sulla matrice di una colonna, formando dei legami di coordinazione per cui le istidine della proteina vengono trattenute dal nichel che è immobilizzato sulla resina, poi con opportuna forza ionica andiamo a rompere il legame tra nichel e tag di istidina
l’His tag non altera il comportamento biologico o immunologico di una proteina
aggiungere imidazolo che va a competere con l’istidina legata al nichel per cui andrà a staccare la mia proteina; infine nell’eluato otterrò sempre più proteina
Proteine terapeutiche ricombinanti
- Ormoni e fattori di crescita
- Citochine. Interferone γ prodotti in in E.Coli tranne due espressi in cellule di CHO
- Fattori di coagulazione ed enzimi
- Vaccini
- Anticorpi monoclonali
EPO ricombinante
Eritropoietina stimola eritropoiesi
Mancanza di EPO endogena è causa di anemia associata a insufficienza renale cronica
Si prende il DNA dell’eritropoietina e si fa esprimere nelle cellule di CHO.
quando si utilizzano farmaci a base proteica qual è il primo effetto collaterale che si può avere? Il sistema immunitario dell’ospite riconosce il farmaco come non proprio, questo accade sulle proteine per cui se iniettiamo nel sangue una proteina il SI subito si attiva, ma se il sistema riconosce le glicosilazioni che rendono la proteina come self la proteina passa identica nel circolo sanguigno rispetto al SI o alcuni enzimi di degradazione.
EPO ricombinante è stata modificata per renderla più efficiente, ma mantiene siti analoghi di glicosilazione,
produzione di due forme ricombinanti dell’EPO, epoetina alfa ed epoetina beta,
CHO, in grado di glicosilare correttamente la proteina, rendendola attiva e conferendo ad essa un tempo emivita più lungo.
FDA ha acconsentito alla commercializzazione di una molecola eritropietinica modificata nella sua componente glucidica, arricchita di residui di acido sialico che ne hanno prolungato l’emivita, ha consentito di ridurre la frequenza delle somministrazioni semplificando la vita del paziente affetto da insufficienza renale cronica
Insulina ricombinante
Insulina peptide formato da 2 catene polipeptidiche = 51 aminoacidi in totale:
– Catena A = 21 amino acidi
– Catena B = 30 amino acidi
Il gene codificante dell’insulina mi permette di ottenere una catena molto lunga costituita da una coda, una sequenza di connessione, una catena A, una catena B e una sequenza leader, che ha una funzione nella maturazione dell’insulina.
Quella però secreta a funzione biologica è costituita da due catene A e B sono legate tramite ponti disolfuro più un terzo ponte disolfuro intracatena.
Per via ricombinante si ottiene insulina come chimera con lacz
I peptidi delle catene A e B sono piccoli e vengono facilmente distrutti, il problema è risolto usando due plasmidi che contengono rispettivamente la seq che codifica per la catena A e la seq che codifica per la catena B, le due porzioni si aggiungono a LacZ e dopo l’espressione vengono purificate, si tratta con bromuro di cianogeno ad azione proteolitica che separa le due catene da lacz, le purifico, con agente ossidante ossido le cisterne a formare i ponti disolfuro ottenendo l’insulina attiva.
