P9: Clonación de un producto de PCR Flashcards
¿Qué son los plásmidos?
Material extracromosomal que se encuentra en algunas bacterias y tienen muchas copias.
¿Por qué los plásmidos pueden replicarse muchas veces?
Porque tienen origen de replicación distinto al de los cromosomas.
¿Qué permite esa característica de extensa replicación de los plásmidos?
Aprovecharlo para hacer clones de un fragmento de ADN (copias idénticas)
En nuestras células, ¿cuantos origenes de replicación hay?
Muchísimos, y cad uno puede usarse sólo una vez por cada ciclo celular.
¿Qué pasaría si en nuestras células el origen de replicacioń se usara más de una vez cada ciclo celular?
podría ocurrir una mutación
¿A qué se le conoce como plásmido recombinante?
Al plásmido que tiene un segmento de ADN que originalmente no tenía, es decir que lo insertamos.
¿Cómo se identifica el ARNm?
por la cola poli A.
¿Cómo puedes extraer el ARNm aprovechando su cola poli A?
Poniendo una columan que tenga secuencia TTTT, para que se quede dentro de la columna.
¿Para que sirve la transcriptasa reversa?
Para sisntetizar DNA a a partir de RNA.
¿Cómo podemos hacer una transcripción reversa de todos los RNA que tengamos en una muestra?
Utilizando un oligo dT, es decir, que tenga una secuencia TTT…T para que se una a las colas poli A.
Si usamos un oligo dT, ¿cuántos productos tendremos?
Tantos como RNA tengamos
¿Qué error comete la Taq polimerasa?
Que les agrega en los extremos una A a los productos que amplifica.
¿Qué ventaja tiene la clonación por medio de productos de PCR de la Taq polimerasa?
Que podemos usar un vector que tenga extremo T, así se une al producto de PCR de manera complementaria.
¿Qué papel tienen las enzimas de restricción en un plásmido recombinante?
Estas enzimas reconocen secuencia específica de DNA y cortan ahí. En este caso “abren” al plásmido y lo vuelven lineal.
¿Qué hace una terminal tranferasa?
adiciona lo que le indiques, por ejemplo al poner Timinas y esa enzima se adicionan T en los extremos.
¿Qué importancia tiene subir la temperatura hasta 94°C al inicio de cada ciclo de PCR?
Desnaturalizar al DNA
¿Por qué se baja la temperatura como segundo paso en cada ciclo de una PCR?
Para que los oligos se unan a sus secuencias blanco. La T depende de los oligos.
¿Por qué se pone en 72°C en cada ciclo de la PCR?
Para que la Taq polimerasa comience la síntesis de ADN.
Tres principales pasos de la PCR
- Desnaturalización de ADN
- Unión de oligos
- Síntesis de ADN (Taq)
¿Qué hace la ADN ligasa?
Une las dos hebras para ligarlas por enlace fosfodiester, y que ahora el plásmido sea recombinante.
¿Qué es la tranformación por choque térmico?
Una forma de que entren los plásmidos a la bacteria. Son competentes porque se encuentran en un medio de cationes que neutraliza, y al dar el choque favorece la entrada del vector hacia la célula.
¿La transfección y la tranformación son lo mismo?
Si, solo que tranfección es en células eucariotas y la tranformación no.
Menciona las características comunes de los vectores:
- origen de replicación
- sitio múltiple de clonación
- sitio que les da resistencia a antibiótico
¿Qué es un sitio de reconocimeinto de enzimas de restricción?
secuencias reconocidas por las enzimas de restricción, para que hagan el ADN lineal y poder incertar ADN exógeno.
