P9: Clonación de un producto de PCR Flashcards
¿Qué son los plásmidos?
Material extracromosomal que se encuentra en algunas bacterias y tienen muchas copias.
¿Por qué los plásmidos pueden replicarse muchas veces?
Porque tienen origen de replicación distinto al de los cromosomas.
¿Qué permite esa característica de extensa replicación de los plásmidos?
Aprovecharlo para hacer clones de un fragmento de ADN (copias idénticas)
En nuestras células, ¿cuantos origenes de replicación hay?
Muchísimos, y cad uno puede usarse sólo una vez por cada ciclo celular.
¿Qué pasaría si en nuestras células el origen de replicacioń se usara más de una vez cada ciclo celular?
podría ocurrir una mutación
¿A qué se le conoce como plásmido recombinante?
Al plásmido que tiene un segmento de ADN que originalmente no tenía, es decir que lo insertamos.
¿Cómo se identifica el ARNm?
por la cola poli A.
¿Cómo puedes extraer el ARNm aprovechando su cola poli A?
Poniendo una columan que tenga secuencia TTTT, para que se quede dentro de la columna.
¿Para que sirve la transcriptasa reversa?
Para sisntetizar DNA a a partir de RNA.
¿Cómo podemos hacer una transcripción reversa de todos los RNA que tengamos en una muestra?
Utilizando un oligo dT, es decir, que tenga una secuencia TTT…T para que se una a las colas poli A.
Si usamos un oligo dT, ¿cuántos productos tendremos?
Tantos como RNA tengamos
¿Qué error comete la Taq polimerasa?
Que les agrega en los extremos una A a los productos que amplifica.
¿Qué ventaja tiene la clonación por medio de productos de PCR de la Taq polimerasa?
Que podemos usar un vector que tenga extremo T, así se une al producto de PCR de manera complementaria.
¿Qué papel tienen las enzimas de restricción en un plásmido recombinante?
Estas enzimas reconocen secuencia específica de DNA y cortan ahí. En este caso “abren” al plásmido y lo vuelven lineal.
¿Qué hace una terminal tranferasa?
adiciona lo que le indiques, por ejemplo al poner Timinas y esa enzima se adicionan T en los extremos.
¿Qué importancia tiene subir la temperatura hasta 94°C al inicio de cada ciclo de PCR?
Desnaturalizar al DNA
¿Por qué se baja la temperatura como segundo paso en cada ciclo de una PCR?
Para que los oligos se unan a sus secuencias blanco. La T depende de los oligos.
¿Por qué se pone en 72°C en cada ciclo de la PCR?
Para que la Taq polimerasa comience la síntesis de ADN.
Tres principales pasos de la PCR
- Desnaturalización de ADN
- Unión de oligos
- Síntesis de ADN (Taq)
¿Qué hace la ADN ligasa?
Une las dos hebras para ligarlas por enlace fosfodiester, y que ahora el plásmido sea recombinante.
¿Qué es la tranformación por choque térmico?
Una forma de que entren los plásmidos a la bacteria. Son competentes porque se encuentran en un medio de cationes que neutraliza, y al dar el choque favorece la entrada del vector hacia la célula.
¿La transfección y la tranformación son lo mismo?
Si, solo que tranfección es en células eucariotas y la tranformación no.
Menciona las características comunes de los vectores:
- origen de replicación
- sitio múltiple de clonación
- sitio que les da resistencia a antibiótico
¿Qué es un sitio de reconocimeinto de enzimas de restricción?
secuencias reconocidas por las enzimas de restricción, para que hagan el ADN lineal y poder incertar ADN exógeno.
¿Qué da la coloración azul a las colonias de bacterias?
X- Gal.
¿Para que se usa X-Gal?
Para detectar la inserción de ADN extraño en la región lacZ del plásmido.
¿Qué pasa si sí se inserta el ADN exógeno en el plásmido con X-Gal?
Veremos colonias blancas, porque el ADN exógeno se inserta en el gen de la beta galactosidasa (colonias recombinadas)
¿Qué tipo de células son las colonias azules marcadas con X-Gal?
Células que no insertaron el ADN exógeno en el gen (no recombinadas), entonces la beta galactosidasa si se expresa.
¿Qué característica les brinda a las células del vector la resistencia al antibiótico?
Que tienen una región que codifica para la beta lactamasa, la cual degrada sus anillos beta lactámicos.
¿Qué nos indica que la célula es resistente al antibiótico?
la expresión de beta lactamasa
¿Qué nos indica que la célula integró la secuencia exógena de ADN?
La ausencia de expresión de la beta galactosidasa. Aquí es donde se verán blancas las colonias.
¿Por qué se pone X-Gal?
Porque cuando hay beta galactosidasa y se rompe, X Gal da coloración azul.
La beta ___________ esla que determina la resitencia-
lactamasa
¿Qué característica tiene un vector universal y puede usarse para el vector que usamos?
Que se une a una secuencia del VECTOR, cercana al sitio donde se inserta el ADN exógeno, por lo que independientemente de lo que se inserte se va a amplificar.
¿Qué hace la ADN ligasa?
crea enlace covalente entre el fosfato del 5’ y el hidroxilo 3’ de las dos secuencias. Ahora tendremos un plásmido recombinante.
¿Qué hemos usado como molde para la PCR?
ADNc, cadena de DNA de cyka, DNA de cola, ahora vamos a usar cultivo.
¿Qué es la transformación?
Método por el cual se introduce material genético externo a bacterias.
¿Qué es la tranfección?
método por el cual se introduce material exógeno genético a células eucariotas.
¿Qué es X Gal?
enzima que corta al sustrato artificial, es sustrato de la beta galactosidasa
¿Qué es el IPTG?
Un inductor (se une al represor del operón de lactosa), entonces ahora hay expresión de la beta lactamasa –> entonces hay resistencia al antibiótico.
V/F
Para que se produzca la beta lactamasa es necesario que la bacteria no tenga disponible glucosa.
Verdadero, porque para que se sintetice la beta lactamasa debe tener expresión del operón de lactosa (el cual tiene un represor cuando sí hay glucosa)
V/F
El IPTG está involucrado en la resistencia de la célula a antibióticos.
Verdadero, es un inductor que se une al represor del operón de lactosa.
X gal está involucrado en la detección de células que tengan el ADN exógeno.
Verdadero. Es azul cuando no se inserta y blanco cuando si (pq interrumpe la expresión de la beta galactosidasa)
