P4: Diseño de oligos para PCR Flashcards
¿Qué son los nucleótidos?
Los monómeros de los ácidos nucleicos
Menciona los dos tipos de ácidos nucléicos
- ADN
- ARN
Función de la ADN polimerasa
Síntesis de ADN
Menciona los 3 procesos necesarios para la síntesis de proteínas
- Replicación
- Transcripción
- Traducción
¿Qué es la replicación del ADN?
Proceso por el cual una molécula de ADN doble cadena es copiada para producir dos moléculas de DNA idénticas.
¿Por qué se dice que la replicación del ADN es un proceso semiconservativo?
Porque se conserva una hebra vieja de ADN para sintetizar una nueva
¿Dónde se lleva a cabo la replicación del ADN?
en el núcleo
¿Qué es la transcripción?
Proceso por el cual se utiliza como molde una hebra de DNA para sintetizar una molécula de RNA
¿Dónde se lleva a cabo la transcripción?
En en núcleo
¿Qué es la traducción?
Proceso por el cual se utiliza una molécula de RNA para sintetizar una proteína.
¿Dónde se lleva a cabo la traducción?
En citoplasma. Es el único proceso que no ocurre en el núcleo celular.
Menciona los tres componentes de un nucleótido.
- Base nitrogenada (A, T, G, C U)
- Azúcar (desoxirribosa o ribosa)
- Grupo fosfato
¿A qué se le conoce como nucleósido?
base nitrogenada + azúcar
¿Qué diferencía al nucleótido del nucleósido?
El grupo fosfato (el nucleótido si lo tiene, el nucleósido solo es la base nitrogenada + azúcar)
¿A qué carbonos nos referimos al decir “prima”?
A los carbonos del azúcar (desoxirribosa o ribosa)
¿Por qué se le llama ‘prima’ a los carbonos del azúcar del nucleótido?
Se hace así para evitar confusiones con los de la base nitrogenada.
¿Qué se encuentra unido al carbono 1 prima del azúcar?
la base nitrogenada
¿Qué hay en el carbono 2 prima del azúcar?
grupo HO (si es ribosa) y H si es desoxirribosa.
¿Qué se encuentra unido al carbono 5 prima del azúcar?
Un grupo fosfato.
¿Qué son los DNTPs?
Nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN.
¿En qué carbono del azúcar se encuentra la gran diferencia entre el ADN y el ARN?
En el carbono 2 prima. Ahí se encuentra un OH o H, para ver si es ARN o ADN respectivamente.
Si tengo un OH en el carbono 2 prima de mi azúcar, ¿qué acido nucléico es?
ARN -porque el azúcar es ribosa-
Si tengo un H en el carbono 2 prima del azúcar, ¿qué ácido nucléico es?
ADN porque es desoxirribosa el azúcar.
¿Con cuántos puentes de hidrógeno se encuentran unidos la A y T?
Dos.
¿Cuántos puentes de hidrógeno unen a la G y C?
Tres puentes de hidrógeno.
¿Cómo se unen las dos hebras de ADN?
Por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (2 o 3, depende que bases sean)
¿Cómo se encuentran unidos nucleótido - nucleótido?
por enlaces covalentes.
¿Cómo puedes separar las dos hebras de ADN?
Subiendo la temperatura. Pues así se rompen los puentes de hidrógeno que unen a las bases nitrogenadas.
¿Cómo se rompen los enlaces covalentes que unen a los nucleótidos?
Sólo por enzimas porque las uniones son muy fuertes.
¿Qué es la hibridación in situ?
Uso de sondas con fluoróforos para identificación.
¿Qué son las sondas usadas en la hibridación in situ?
Secuencia complementaria para el ARNm que queremos poner en evidencia.
¿Qué necesitamos para que un gen se exprese?
que se transcriba
Explica el principio de la electroforesis.
Los ácidos nucléicos tienen carga negativa, entonces al aplicar un campo eléctrico van a migrar hacia el polo positivo. Los pequeños migrarán más rápido que los grandes y por eso veremos bandas distintas que corresponden a los pb.
V / F
Los ácidos nucléicos tienen la capacidad de absorber luz UV.
Verdadero. Es por ello que podemos verlos en el espectrofotómetro.
Longitud de onda que los ácidos nucléicos absorben mejor.
260 nanómetros.
¿Por qué los ácidos nucleicos son capaces de absorber luz UV?
Por los anillos de las bases nitrogenadas.
¿Cómo puedes saber la pureza de un ácido nucléico con el espectrofotómetro?
Dividiendo las densidades ópticas (DO) de la muestra a los 260 nm / 280 nm.
¿Qué resultado deberíamos obtener de una muestra pura al dividir DO 260 nm / DO 280 nm?
- Entre más alejados del 2, más contaminada está nuestra muestra.
¿Por qué el resultado 2 indica una buena pureza de un ácido nucléicon en el espetrofotómetro?
Porque la absorbancia a 260 nm es casi el doble que a 280 nm.
¿En qué dirección se da la síntesis de ADN?
Siempre es 5’ — 3’
¿Qué enzima se encarga de la síntesis de ADN?
ADN polimerasa
¿Cómo es la estructura del ADN?
Doble cadena en sentidos antiparalelos.
Requisitos para sintetizar ADN.
- ADN polimerasa
- Cadena molde
- Origenes de replicación
¿Qué es un origen de replicación?
Sitio donde la ADN polimerasa va a comenzar a sintetizar el ADN.
¿Las dos hebras de ADN al replicarlo se sintetizan de manera continua?
No, una si es de manera continua pero otra se replica en fragmentos -cada fragmento necesita su primer-
Una hebra de ADN se replica en fragmentos, ¿qué enzima se encarga de unirlos?
ADN ligasa.
¿Qué es un oligo / primer/ sebador?
Fragmento de ARN sintetizado por otra enzima que va a indicar el lugar a la ADN polimerasa desde donde va a comenzar a sintetizar.
¿En qué dirección se sintetiza el ARN?
5’—- 3’
¿A qué se le llama amplicón?
Fragmento de ADN amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR
¿A qué nos referimos con self- dimmers?
A que la cadena es capaz de complementarse entre ella, como que se enrolla sobre sí misma.
¿Qué es un primer?
Molécula de ácido nucléico con una alta afinidad por un blanco específico.
¿Cuál es el tamaño ideal que debe tener un oligo?
18 a 24 pb.
V / F
Los oligos deben tener T de fusión similar.
Verdadero.
Deben tener máximo 1°C de diferencia.
¿Qué fórmula se utiliza para calcular la T de fusión de los oligos?
Fórmula de Wallace.
Utilidad de la Fórmula de Wallace.
Cálculo de la Tm de los oligos.
¿Qué toma en cuenta la fórmula de Wallace para calcular la Tm de un oligo?
La cantidad de A + T y las G + C.
¿Cuál es la T de fusión aproximada que deben tener los oligos?
~ 60 °C
Los oligos deben ser _______, es decir, que tengan una secuencia única en el molde de ADN que se requiere amplificar.
especificos
¿A qué nos referimos con complementariedad de los oligos?
Capacidad que tengan para formar homodímeros, heterodímeros o hairspines.
¿Cuándo se forma un heterodimero?
Cuando un oligo sentido se une con antisentido
¿Cuándo se forma un homodimero?
Cuando un oligo sentido se une con otro sentido. O un antisentido con otro antisentido.
¿Cuándo se dice que el oligo forma un hairspin?
Cuando se plieg asobre sí mismo.
¿Qué porcentaje de G/C debe tener un oligo?
45% al 55% para que haya distribución homogénea de las bases, porque eso influye en la Tm.
V / F
En el diseño de oligos se debe incluir mínimo un residuo de G o C en las últimas 5 bases de ambos extremos.
Verdadero. Pero cuando mucho que sean 2.
Se hace con el fin de dar estabilidad.
¿Por qué es necesario incluir al mneos un residuo de G o C en las últimas 5 bases de los extremos de los oligos?
para dar estabilidad
¿Cuántos oligos son necesarios para la replicación del ADN?
Mínimo dos: uno forward y otro reverse.
¿Cómo se diseña el oligo sentido?
Transcribiendo la secuencia 5’ — 3’directamente.
¿A qué hebra se pega el oligo sentido?
A la complementaria
¿Cómo se diseña el oligo reverse?
Escribiendo la cadena complementaria de la hebra original, despues invertir el sentido.
¿A qué hebra de ADN se pega el oligo reverse?
a la hebra original.
Entre _______ sean los amplicones, más eficientes serán las amplificaciones
menor (tamaño)
¿En que nos podemos basar para ver si un oligo es buena opción?
en su Tm, entre mayor sea
6 requisitos para diseñar un oligo.
- Tamaño entre 18-24 pb-
- T de fusión entre 55 - 58 °C.
- Especificidad
- Formación de estructuras secundarias.
- 45 - 55% de G/C
- Extremos con G o C
¿Qué importancia tiene evitar la formación de dímeros de oligos?
Evitar que puedan competir con la amplificación del producto deseado.
¿Cómo se le llama a cuando el oligo se une a su secuencia complementaria?
hibridación in situ :)
¿Cuánta diferencia de bases debe haber máximo entre los dos oligos?
Máximo 3 bases de diferencia.
El tamaño del oligo es _______ a la eficiencia de hibridación.
Proporcional.
Entre más grande sea el oligo, mas ineficiente será la reacción.
¿A qué nos referimos con que un oligo debe ser específico?
A que debemos elegir oligos que tengan una secuencia única en el molde de ADN que queremos amplificar.
¿Por qué no debe haber sitios ricos en A / T en el oligo?
Porque son inestables y pueden hacer menor la eficiencia de amplificación.
¿Qué cadena se usa como molde para la replicación?
La cadena original (codificante)
Importancia del MgCl2 en la PCR
Es un cofactor necesario para la actividad enzimática de las DNA polimerasas
