Outils &méthodes Flashcards
Artéfact
Structure artificielle apparaissant
lors de la préparation de
l’échantillon pour son observation
au microscope.
Comment prouver qu’une
structure n’est pas un artéfact
(=est-ce que la structure est là ou pas là) – Préparer les échantillons de différentes façons – Différents fixateurs ou sans fixateur (congélation rapide et cryodécapage)
Un exemple de cause d’artéfacts
– Fixateurs • Qui causent la précipitation ou coagulation de substances normalement dépourvues de structure dans la cellule
cmt avoir une meilleure résolution d’image?
- Grossir
- + de pixels
Limite de résolution (d)
=expression quantitative de la capacité de
grossissement efficace d’un appareil optique.
-La distance minimale (d) (centre à centre) de 2 points qui peuvent être distingués comme tels.
équation de d
= 0,61λ/n*sinα
O.N
=ouverture numérique=ouverture au niveau de l’objectif=n*sinα
n
indice de réfraction
α
demi-angle d’ouverture du cône
lumineux
Plus λ baisse…
…Plus la résolution est claire
Solutions au problème du grossissement efficace: En lumière visible
– Amélioration de la limite de résolution en éclairant la préparation avec de courtes
longueurs d’onde (ex. lumière bleue).
Solutions au problème du grossissement efficace: En lumière ultraviolette
– À 200 nm on réussit à baisser de moitié la limite de résolution par rapport à la lumière
visible (400 nm).
’inconvénients à utiliser la lumière ultraviolette.
- Optique en quartz et non en verre qui est opaque aux U.V.
- Miroir à première surface (couche métallique non recouverte de verre)
- Invisible pour l’œil humain
Le microscope électronique à transmission (MET)
• L’utilisation d’un faisceau d’électrons comme source d’éclairage améliore la
limite de résolution.
• La limite de résolution obtenue suit la même formule qu’en photonique
formule longuer d’onde pour MET
λ(en mm)=h/mv=1,23/sqrt(V)
comparaison photonique vs MET
– Au photonique la longueur d’onde moyenne est de 500 nm et la limite de résolution de 0,2 µm
-– Au MET à 100 000 V (avec O.N. de 0.01), on obtient un λ de 0,004 nm et une limite de
résolution de 0,00025 µm… donc 1000 fois mieux.
===> MET permet une meilleure résolution et donc un grossissement efficace plus fort.
Contraintes MET
– Faire le vide
– Préparations très minces (0,5 µm)
– Cellules mortes
– Coût élevé
Le microtome
Le couteau est fixe, alors que le spécimen à couper
est mobile.
L’ultramicrotome
coupe encore plus mince car desfois e- passent pas
rincer au toluéne fait quoi lors de la préparation d’un spécimen?
élimine les lipides
Cryodécapage
- Sépare les couches de l’organelle
- de contraste
- de relief
L’amélioration du contraste des préparations
en photonique
• Colorants usuels
– Approche empirique et histocytochimie
• Fluorochromes
– Fluorescence primaire
• Substances qui fluorescent naturellement (ex: collagène)
– Fluorescence secondaire
• Substance qui doivent être colorées par les fluorochromes
– Immunofluorescence
• Cytoenzymologie
coloration négative
- e- passent= clair
- e- passent pas = sombre
Ombrage
L’ombrage se réalise uniquement
sur des structures tridimensionnelles
==>les e- passent ou il y a du métal
Peut-on réaliser la technique de
l’ombrage sur des coupes à
l’ultramicrotome ?
nn, pas de relief= 0 ombrage
Sur des préparations obtenues par
cryodécapage ?
oui, réplique avec du relief donc il poiurrait avoir dépot
sur des virus
oui (pas des coupes mais complet)
La réaction de Gomori
-en cytoenzymologie
β-glycérophosphate —————————– > Glycérol + Phosphate inorganique
(+PbNO3 à pH 5) + PbNO3
PbNO3
Phosphate de plomb
Précipité dense aux électrons
Anticorps couplée à la ferritine
– Protéine dense aux électrons
-Immunocytochimie
Anticorps couplée à une enzyme
Immunocytoenzymologie
Méthodes basées sur l’éclairage
– Permettent l’observation contrastée de cellules vivantes
spécialité contraste de phase
-délimitation cell +apparentes
Propagation d’un train d’ondes lumineuses dans divers milieux
Les différences de concentration ou de composition des diverses solutions sont accompagnées de
différences d’indice de réfraction auxquelles correspondent des différences de phase imperceptibles
à l’œil humain. Le microscope à contraste de phase transforme les différences de phase en
différences d’amplitude perceptibles à l’œil humain.
L’autoradiographie
Utilisée en photonique et au MET
=> la ou radiactif
La centrifugation différentielle
étudier partie de cellules, de quoi elle est composé
==> isolement d,élements de la cellule
Comment étudier spécifiquement
les propriétés d’une organelle ?
structures + petites sédimentent en premier
Centrifugation zonale
Centrifugation basée sur l’équation de Stokes,
mais où l’homogénat est déposé en surface d’un
léger gradient de saccharose.
La centrifugation différentielle
Par centrifugation en gradient de
densité, basée uniquement sur la
densité.
2 types de gradient :
Gradient discontinu (variation du gradient de plus en plus dense)
Gradient continu
(en escalier, dense au milieu et on ajoute)
