Outils &méthodes Flashcards
Artéfact
Structure artificielle apparaissant
lors de la préparation de
l’échantillon pour son observation
au microscope.
Comment prouver qu’une
structure n’est pas un artéfact
(=est-ce que la structure est là ou pas là) – Préparer les échantillons de différentes façons – Différents fixateurs ou sans fixateur (congélation rapide et cryodécapage)
Un exemple de cause d’artéfacts
– Fixateurs • Qui causent la précipitation ou coagulation de substances normalement dépourvues de structure dans la cellule
cmt avoir une meilleure résolution d’image?
- Grossir
- + de pixels
Limite de résolution (d)
=expression quantitative de la capacité de
grossissement efficace d’un appareil optique.
-La distance minimale (d) (centre à centre) de 2 points qui peuvent être distingués comme tels.
équation de d
= 0,61λ/n*sinα
O.N
=ouverture numérique=ouverture au niveau de l’objectif=n*sinα
n
indice de réfraction
α
demi-angle d’ouverture du cône
lumineux
Plus λ baisse…
…Plus la résolution est claire
Solutions au problème du grossissement efficace: En lumière visible
– Amélioration de la limite de résolution en éclairant la préparation avec de courtes
longueurs d’onde (ex. lumière bleue).
Solutions au problème du grossissement efficace: En lumière ultraviolette
– À 200 nm on réussit à baisser de moitié la limite de résolution par rapport à la lumière
visible (400 nm).
’inconvénients à utiliser la lumière ultraviolette.
- Optique en quartz et non en verre qui est opaque aux U.V.
- Miroir à première surface (couche métallique non recouverte de verre)
- Invisible pour l’œil humain
Le microscope électronique à transmission (MET)
• L’utilisation d’un faisceau d’électrons comme source d’éclairage améliore la
limite de résolution.
• La limite de résolution obtenue suit la même formule qu’en photonique
formule longuer d’onde pour MET
λ(en mm)=h/mv=1,23/sqrt(V)
comparaison photonique vs MET
– Au photonique la longueur d’onde moyenne est de 500 nm et la limite de résolution de 0,2 µm
-– Au MET à 100 000 V (avec O.N. de 0.01), on obtient un λ de 0,004 nm et une limite de
résolution de 0,00025 µm… donc 1000 fois mieux.
===> MET permet une meilleure résolution et donc un grossissement efficace plus fort.
Contraintes MET
– Faire le vide
– Préparations très minces (0,5 µm)
– Cellules mortes
– Coût élevé
Le microtome
Le couteau est fixe, alors que le spécimen à couper
est mobile.
L’ultramicrotome
coupe encore plus mince car desfois e- passent pas
rincer au toluéne fait quoi lors de la préparation d’un spécimen?
élimine les lipides
Cryodécapage
- Sépare les couches de l’organelle
- de contraste
- de relief
L’amélioration du contraste des préparations
en photonique
• Colorants usuels
– Approche empirique et histocytochimie
• Fluorochromes
– Fluorescence primaire
• Substances qui fluorescent naturellement (ex: collagène)
– Fluorescence secondaire
• Substance qui doivent être colorées par les fluorochromes
– Immunofluorescence
• Cytoenzymologie
coloration négative
- e- passent= clair
- e- passent pas = sombre
Ombrage
L’ombrage se réalise uniquement
sur des structures tridimensionnelles
==>les e- passent ou il y a du métal
