Oprensning af amyloider

Question 1

Forklar princippet bag opresning.

Answer 1

Princippet bag dette er at lysere cellerne, hvorefter andre cellekomponenter gøres opløselige, mens amyloiderne forbliver på deres uopløselige form.

Question 2

Lysering, forklar

Answer 2

Lysering af cellerne foretages via fryse/tø-cykler, hvor cellerne udsættes for skiftevis nedkølning til -80 °C og opvarmning til 37 °C. Nedfrysning og optøning forårsager mekanisk stress på cellemembranen ved skiftevis udvidelse og sammentrækning, hvilket resulterer i cellelysis.

Question 3

RNase A og Dnase I, lysozym hvorfor bruges dette.

Hvad kræver DNase

Answer 3

For at undgå høj viskositet af prøven nedbrydes nukleinsyrerne med DNase og RNase. DNase I kræver divalente cationer, tilsættes MgCl2.

Lysosym hydrolyserer β-1,4-Glykosidbindinger i bakteriers peptidoglycan, hvorfor pepti- doglycanen gøres opløselig. Dette bidrager til lysering af cellen, da lysosymet nedbryder peptidoglycankomponenten af cellevæggen

Question 4

Triton X-100:

Answer 4

Yderligere tilsættes den ikke-ioniske detergent Triton X-100. Denne har til formål at gøre lipider og membranproteiner opløselige. Triton X-100 bidrager også til lysering ved at inkorporere sig i cellemembranen

Question 5

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS):

Answer 5

the sample is heated in SDS to unfold and dissolve contaminating proteins. The major advantage of this strategy is that it can be used to isolate amyloids that are tightly associated with the bacterial cells or integrated in the cell wall.

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Dette er en anionisk surfaktant, der denaturerer proteiner og gør dem opløselige. SDS medvirker til lysering af celler, da den ligsom Triton X-100 virker som detergent, og gør phospholipider opløselige