Observations microscopiques Flashcards
Combien de types de microscopes existe-t-il??
2 : photonique et électronique
En quoi sont-ils différents?
Les principes physiques des deux microscopes sont semblables. Cependant, le photonique bombarde l’objet avec des photons alors que l’électronique bombarde l’objet avec des électrons ce qui aura un effet direct sur le grossissement.
Pourquoi y’a-t-il une différence dans le type de bombardement?
Les longueurs d’onde utilisées ne sont pas les mêmes
Pourquoi faut-il une structure complexe pour le microscope électronique?
Comme on parle de détails de l’ordre du nm, une simple secousse pourrait complètement changer l’image
De quoi est composer un microscope?
Un condensateur, un objectif et un oculaire
Comment fonctionne un microscope photonique?
Des faisceaux composés de photons sont envoyé au niveau du condensateur. Ce dernier va condenser tous les faisceaux et les diriger vers l’objectif où un premier grossissement de l’image sera fait. Ensuite, les photons vont se rendre au niveau de l’oculaire où le deuxième grossissement de l’image sera effectué et une image visible pour l’utilisateur conçue
Quels sont les différents grossissements possible au niveau de l’objectif?
10x, 40x, 100x et 200x (pour les plus cher)
Quels sont les différents grossissement pour les oculaires?
10x et 15x (pour les plus couteux)
Quel est le grandissement maximal de l’image obtenue sur le microscope photonique?
L’agrandissement est de 3000x pour les microscopes les plus couteux.
Qu’est ce qui limite cet agrandissement pour les microscopes photoniques?
La limite de résolution
Qu’est ce qu’est la limite de résolution?
Il s’agit de la distance minimale entre deux points qui peuvent être perçus comme étant distincts
Y’a-t-il des facteurs sur lesquelles ont peut intervenir?
Oui, il est possible de changer la longueur d’onde en utilisant par exemple les ultraviolets au lieu d’une longueur visible pour l’humain pour avoir une longueur d’onde plus petite.
Quelles sont les longueurs d’ondes dans le visible et dans l’ultraviolet?
400 à 700 nm et de 180 à 400 nm
Quelles sont les désavantages de ce méthode?
Tout d’abord, les verre normaux sont opaques aux UV, il serait possible d’utiliser du quartz mais trop cher. Ensuite, possibilité de développer des maladies de la rétine dû aux UV et pour finir il faut toute une transformation optique pour rendre l’image dans l’ordre du visible.
Un autre facteur?
Oui, l’indice de réfraction du milieu. Immerger la lentille dans de l’huile pour que l’indice de réfraction de l’air ne dévie pas trop les rayons et que pour ces derniers soient en contact avec un indice de réfraction similaire à celui qu’ils viennent de quitter.
Pour quels objectifs est utiliser l’huile à immersion?
Ceux qui ont un fort grossissement (60-100)
Quelle est la limite de résolution moyenne, plus petite et plus grande pour les microscope photonique?
0,21 u, 0,1u , 0,27 u
Quel est le dernier facteur sur lequel on peut intervenir?
teta, qui vaut 1\2 de l’angle du cône de lumière entrant dans l’objectif. Cependant, il s’agit d’une limite de construction de l’objectif, doit dépenser plus pour régler ce problème.
Quelle est l’autre limite du microscope photonique?
Le contraste
Qu’est ce qu’est le contraste?
Il s’agit de la capacité de distinguer une structure de son environnement
À quoi est proportionnel le contraste?
À la différence de quantité de lumière absorbée entre la structure et son milieu
En quoi consiste le microscope à fond clair?
Il s’agit d’avoir une structure sombre sur un fond clair.
Qui a inventé ce microscope?
Köhler
Quel effet ont les préparations à l’état frais sur le contraste?
Elles vont faire baisser le contraste
Sur quoi on n’intervient pas au niveau du microscope à fond clair?
La lumière incidente
Comment sont les préparations du microscope à fond clair?
Il s’agit de préparation à l’état frais
quelle effet sur le contraste?
Présence d’une diminution du contraste
Comment se fait la préparation à l’état frais?
On dépose une goutte sur laquelle on rajoute une lamelle. On peut ensuite directement observé sur le microscope à fond clair.
Avantages de la préparation à l’état frais?
On observe des organismes qui sont vivants :
- Morphologie
- Motilité (déplacement)
- Possibilité d’observer l’axe de division cellulaire pour les protozoaires
- Corps d’inclusion cytoplasmiques, on travaille sur des microorganismes de grosses tailles (incapable d’observer les virus)
Comment faire pour augmenter le contraste?
On peut avoir recourt à une coloration qui va s’attacher aux microorganismes et rien dans le milieu
De quel type sont les colorants?
Il existe peu de colorants vitaux
Qu’est ce qu’exige l’augmentation du contraste et qu’est-ce qu’elle permet d’observer?
Elle exige une fixation et une coloration dans le but d’observer la morphologie et les arrangements des microoganismes
Grâce à quoi se fait la coloration?
La charge et l’hydrophobicité
Qu’est ce qu’est la coloration simple?
L’utilisation d’un seul colorant de manière uniforme. Dans ce cas, on va utilisé le bleu de méthylène (+) pour observer une majorité de microorganismes dont les parois sont (-)
Qu’est ce qu’une coloration différentielle?
Une coloration qui permet de discriminer différents groupes bactérien ou groupe à l’intérieur du microoganisme.
Exemple d’une coloration différentielle pour Gram?
Rétention du violet de cristal qui se fait si la paroi est Gram + (microorganisme en violet) alors qu’il n’y aura aucune rétention si la paroi est Gram - (le microorganisme sera rouge
Expliquer la coloration différentielle Alcoolo-acido-résistance?
Il s’agit d’une coloration utilisée pour faire le diagnostique des mycobactéries en clinique. Ces microorganismes ont une croissance lente (1 mois avant d’avoir une colonie) mais leur parois retiennent le Carbol-Fuchsine malgré la présence d’acide ou d’alcool (décolorants très puissants ) qui permet de directement détecter leur présence sans attendre le temps d’incubation.
Que permet d’observer les colorations différentielles?
- Endospores (organe de résistance)
- Capsules ( structure impliquée dans la pathogénicité)
- Flagelles ( pour le déplacement)
- Corps d’inclusion
Qu’est ce qu’est le microscope à fond noir?
Il s’agit d’observer des structures claires sur un fond noir
Différences entre celui à fond clair et fond noir?
De l’extérieur, il n’existe pas de différences entre les deux. Cependant, les différences sont au niveau des composantes du condensateurs. Présence de cône de Abbe (oriente les faisceaux de manière oblique) + miroir, présence d’un éclairage oblique + observation des rayons déviées par les structures cellulaires.
Les cellules sont-elles vivantes lorsqu’on observe au microscope à fond noir?
Oui, il s’agit d’une visualisation de structures sans colorations ni fixations
Différence entre celui à contraste de phase et fond clair?
De l’extérieur, les deux se ressemblent. Existe des différences au niveau du condensateur. Présence d’anneaux de phase pour celui à contraste de phase en plus des objectifs
Principe du microscope à contraste de phase?
Mise en phase de la lumière incidente pour que les faisceaux aient la même longueur et la même amplitude. En contact avec des structures cellulaires, il y’aura réfraction de la lumière par les structures, changement de la phase de la lumière et changement d’intensité de la lumière causé par les indices de réfraction différents. Au niveau de la deuxième lame de phase, on va soit amplifier ou annuler les différences de phases
Comment va être l’image sur un microscope à contraste de phase?
On va observer une image sombre sur un fond clair, d’où l’utilisation d’un filtre coloré pour faciliter l’observation
Que permet d’observer le microscope à contraste de phase?
Visualisation des structures fines sans coloration ou fixation (les cellules sont donc vivantes)
Est-t-il plus récent que le fond noir et qui l’a créée?
Oui il est plus récent que le fond noir. Son créateur est Zernike qui a gagné le prix nobel de 1953
Comment fonctionne le microscope à interférence différentielle?
Un système de lentilles polarisantes contrôlées par ordinateur s’occupe de polariser la lumière sur différents angles. En contact avec des structures ayant chacune leur indice de réfraction, la polarisation de la lumière va changer et l’intensité lumineuse sera différente. On aura une forme de coloration vive et une impression de pseudo-relief 3D.
Différence avec le microscope à fond clair et interférence différentielle?
Seulement au niveau du condensateur où il y’a un système de lentilles polarisantes contrôlées par informatique.
Est-ce qu’on visualise des cellules vivantes?
Oui, il n’y a pas de coloration ou de fixation nécessaire tuant les cellules pour visualiser les structures fines recherché.
Différence entre le microscope à contraste de phase et interférence différentielle?
Absence d’un halo de diffraction de la lumière présent sur l’image du microscope à contraste de phase créer par la perturbation lumineuse
Quelle est la limite du microscope à interférence différentielle?
Les préparation qu’on souhaite observer doivent être transparentes pour que la lumière polarisée puissent traverser la structure avec un changement de polarisation
Quel est le grossissement maximal pour un microscope photonique vs electronique?
- grossissement 1000 vs 400 000
- LR 0,1u vs 0,05 nm
Longueur d’onde des électrons vs photons?
- 5x10^-12 pour e alors que photons 5x10^-7m
Comment est le condensateur et les lentilles de l’objectif et l’occulaire?
Le condensateur est formé d’électro-aimants et les lentilles sont des lentilles magnétiques
Peut-on percevoir l’image d’un microscope électronique directement?
Non, on a besoin d’un écran fluorescent, d’une plaque photographique ou d’un détecteur numérique.
Le matériel est-il vivant en microscopie électronique?
Non, car le vide poussé tue les microorganismes
Pourquoi le matériel vivant ne peut pas être utilisé dans tous les cas?
Le matériel vivant est non électron-dense ce qui fait baisser le contraste
Par quoi se fait la coloration nécessaire?
Des matériaux imperméables aux électrons comme l’acide phosphotungstique ou des métaux (Fer, or, lanthane et uranium)
Expliquer la technique d’ombrage?
On vaporise des métaux à un angle de 45degrès sur l’échantillon. Les métaux réfracteront les é et l’image sera noir alors que la partie ombrée de l’échantillon sera clair
Dans quel technique peut-on utilisé des billes témoins pour mesurer la taille?
Technique de l’ombrage où l’ombre de la bille permettra de faire des comparaisons
Qu’est ce qu’est la coloration négative?
On va utiliser de l’acide phosphotungstique qui va s’accumuler dans les creux en les rendant sombres alors que les protubérances du relief sera claire
Que permet d’observer la technique de coloration négative?
La structure des virus
Expliquer la cryodécapage?
On va congeler à -180degrès l’échantillon rapidement. Ensuite, utilisation d’une coupe transversale qui permettra d’ouvrir la cellule en deux aux niveaux de faiblesse. Pour observer les organites, on va utiliser la coloration d’ombrage à l’aide de métaux
Qu’est ce qu’est l’immuno-localisation cellulaire en microscopie électronique?
Il s’agit de conjuguer un anticorps d’une protéine spécifique à une bille de fer ou d’or. Va être utiliser pour localiser une protéine dans une cellule.
Comment fonctionne le microscope électronique?
Les électrons vont traverser l’échantillons et se loger dans le détecteur sous l’échantillon. Ensuite, on aura une image par transparence.
Qu’est ce qui fait baisser la limite de résolution du MET?
Il faut absolument que les structures soient très fines
Qui a la meilleure limite de resolution MET ou MEB?
MEB
Concept de la cryoélectromicroscopie et cryotomographie?
Congélation rapide à -135 degrès avec de l’azote ou éthane qui permettra une vitrification des tissus avec l’eau contenue dans le but d’avoir une conservation de l’intégrité des structures sous vide.
Lorsqu’on utilise ces deux méthodes, faut-il adapter le microscopes?
Oui, l’intérieur doit être aussi froid pour pas perdre la vitrification
En quoi consiste la cryoélectromicroscopie?
Modélisation des structures protéiques comme la protéine SPIKE du SARS-CoV-2-ACE2
En quoi consiste la tomographie?
La prise d’image sous différents angles pour avoir une image 3D par reconstruction informatique de l’échantillon sans utiliser de coupes
Comment fonctionne le microscope confocal à balayage laser?
Il va y avoir une illumination par laser UV pour stimuler des fluorochromes et détecter la fluorescence exclusivement du plan au foyer dans le but d’éliminer la fluorescence des plans hors foyer ce qui fera augmenter les contrastes et diminuer les interférences.
Comment est le balayage du laser?
Horizontale, vertical et temporel
Comment se fait la numérisation de l’image?
Reconstitution et quantification informatique
Comment peut être cette reconstitution?
Elle peut être en 3D ou 4D (temporel)
Application du microscope confocal à balayage laser?
-Détection ou localisation d’une structure dans une cellule ou un tissu
- Développement d’un biofilm en fonction du temps
- Quantification + localisation des cellules mortes ou vivantes
Qui a inventé le microscope à effet tunnel?
Rohrer et Binnig et ont eu le prix Nobel de 1986
Principe du microscope à balayage de sonde?
Sonde balaie la surface et ensuite on mesure le déplacement vertical et horizontale de cette sonde et le courant entre les nuages é;ectroniques
Que peut-on observer?
Les liens intermoléculaires et des observations en milieu aqueux
qu’est ce qu’utilise le microscope à force atomique?
- Des nanotechnologies et Biomatériaux
