Observation microscopique des microorganismes Flashcards
Quels sont les 2 grands types de microscopes et quels sont les longueurs d’ondes observées par chaque?
Photonique: um
Électronique: nm
Quelles sont les différences majeures entre le microscope photonique et le microscope électronique?
Les particules bombardées sur l’échantillon et le grossissement
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Le système de lentille est composé de: (3)?
Condensateur (entre source lumineuse et échantillon)
Objectif (1er système de lentille, agrandit 1ère fois)
Oculaire (près oeil, agrandit 2ième fois)
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Qu’est-ce que la limite de résolution?
Distance minimale entre deux points qui peuvent être perçus comme distincts.
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution: λ / (2nsinØ)
Que signifie chaque composante?
λ: longueur d’onde
n: indice réfraction (change selon milieu)
Ø: 1/2 de l’angle du cône de lumière entrant dans objectif
nsinØ = Ouverture numérique = prédéfinit => écrit sur l’objectif ex: 0,90
LR = 0,21 u (centre spectre électromagn)
lumière blanche: 0,2 u
meilleurs microscope: 0,1 u
- violet : augmente limite résol
- rouge: diminue limite résol
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution:
Facteurs où l’on peut intervenir = λ
–> comment?
(λ, n et Ø)
λ: longueur d’onde
- visible = 400 à 700 nm
- ultraviolet = 180 à 400 nm (ce qu’on voudrait voir)
problème UV: verre = opaque aux UV –> quartz$
à l’extérieur du visible
transformation optique
sécurité –> nocif pour yeux
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution:
Quels sont les 3 facteurs où l’on peut intervenir?
λ, n et Ø
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution:
Facteurs où l’on peut intervenir = n
–> comment?
(λ, n et Ø)
n: indice de réfraction du milieu: identifié sur objectif
- déviation de la lumière entre échantillon et 1er
système de lentille
- n air: 1,0
verre: 1,5
huile à immersion: 1,56 –> diminue déviation
—> diminue limite de résolution
–> sur objectif à fort grossissement : 50 - 100x
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution:
Facteurs où l’on peut intervenir = Ø
–> comment?
(λ, n et Ø)
Ø: 1/2 de l’angle du cône de lumière entrant dans
objectif
- + angle est grand, + limite de résolution = faible
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Qu’est-ce que le contraste?
Capacité à distinguer une structure de son environnement
–> proportionnel à la différence de quantité de lumière absorbée
–> structure vs milieu
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond clair
Caractéristiques:
aspects structure + fond?
Préparation, cellules vivantes ou mortes
coloration?
- structures sombres sur fond clair
- préparation à l’état frais! cell vivantes!
- morphologie, motilité, division cell., corps
inclusion cytopl.
—> diminue contraste
Comment augmenter contraste? COLORATION
VRAI ou FAUX
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond clair
Un lame ayant subit une coloration peut présenter des organismes morts ou vivants
FAUX
organismes morts seulement!
Existe peu de colorant vitaux
Exige fixation + coloration –> réarrangement
morphologie
Colorants =
- hydrophobes (ex membrane lipidique)
- chargés + ou - (ex organisme absorbe lumière,
coloré sur fond clair)
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond clair
Quels sont les 2 classes de coloration qui existe pour colorer lame? + développer
Coloration simple :
1 seul colorant ex: bleu de méthylène (+),
colorant uniforme
Coloration différentielle:
2 types:
- Gram
- AAR (Alcoolo-acido-résistance)
Ziehl Nelson
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond clair
Quels sont les 2 types de coloration différentielles?
Sur quelles bases cette coloration fonctionne-t-elle?
!Coloration de Gram:
Gram + : retient cristal violet (violet) <400nm
Gram - : ne retient pas cristal violet (rouge)
>700nm
Dépend structures parois bactéries Discrimine grands groupes microbiens Capacité certaines cellules retenir pigment spécifique
!AAR (Alcoolo - acido - résistance):
But: savoir si contient mycobactéries
Rétention carbone-fusine
–> pigment retenu malrgé lavage acide et alcool
Discrimine:
- endospores
- capsules
- flagelles
- corps d’inclusion
Quels sont les 5 types de microscopes photoniques?
- Microscope à fond clair
- Microscope à fond noir
- Microscope à contraste de phase
- Microscope à contraste d’interférence différentielle
- Microscope à (épi)fluorescence
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond noir
Quelles sont les différences avec microscope fond clair?
presque identique à fond clair mais:
pas besoin fixation
pas besoin coloration
Différence dans condensateur:
- cône de Abbe + miroirs
- éclairage oblique
- visualisation rayons déviés
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond noir
Caractéristiques:
Fixation? coloration?
cellules vivantes ou mortes?
Altérations?
Intérieur microscope?
Ce que l’on voit?
différences dans condensateur?
pas besoin fixation
pas besoin coloration
cellules vivantes (état frais)
pas crainte altération
cône opaque dans condensateur + miroir oblique
structures claires sur fond noir
Différence dans condensateur:
- cône de Abbe + miroirs
- éclairage oblique
- visualisation rayons déviés (fond noir: ne dévit pas
la lumière)
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste de phase
Qu’est-il possible de voir sur image?
halo autour de l’image
Images sombres sur fond clair (filtres coloré)
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste de phase
Caractéristiques:
Extérieur?
Différences internes?
principe?
qui l’a découvert + Nobel?
Que voit-on?
Coloration? fixation?
Extérieur ressemble à fond clair
Différences internes: condensateurs et objectifs –>
Anneaux de phase (lumineuse)
Principes: mise en phase de la lumière incidente
Réfraction lumière par les structures cellulaires =
changement de phase de la lumière = changement
intensité lumière
Zernicke Nobel 1953
Structures de densité différentes (contraste intensifié)
- réfractions différentes
- intensités lumineuses différentes
Images sombres sur fond clair –> filtres colorés
Visualisation de structures fines sans coloration ni
fixation –> cellules vivantes
Toute la lumière qui arrive = mise en phase (unifromisée) –> crête + creux s’annulent
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste d’interférence différentielle
caractéristique ce que l’on voit?
pseudo-relief 3D
Pas de halo de diffraction (contraste de phase)
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste d’interférence différentielle
Qui l’a inventé?
différences avec les autres?
Nomarski
- lumière polarisée à angle variable
- réfractions différentes –> modification polarisation
- intensités lumineuses différentes
coloration vive + impression pseudorelief 3D
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste d’interférence différentielle
Différence avec autres microscopes (objet)?
système lentilles polarisantes controlés par infromatique
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste d’interférence différentielle
Qu’est-ce qu’on visualise?
coloration? fixation?
limites?
structures fines
sans coloration ni fixation
limite = préparations transparentes
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence
colorants?
principe?
colorants fluorescents (fluorochromes)
Absorption UV -> émission visible
- lampe UV: excitatrice
- Filtre sélectif (bloquant)
- Observations (visible)
UV passe dans quartz -> objet -> réflexion visible -> visible réfléchit dans le verre –> oeil
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence
Quelles sont ses différentes applications?
- Fluorochromes vitaux
- Immunofluorescence
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence
Application (2)
Fluorochromes vitaux
Distinction cellules vivantes et cellules mortes
vivantes: (verte) exclusion membrane cytoplasmique
(imperméable)
mortes: (rouge) membrane cytoplasmique =
perméable
- différence dans longueur d’onde absorbée
énumération différentielle par logiciel d’analyse d’image
Exemple but: savoir quelles cellules peuvent faire cultures (vivantes) et quelles ne peuvent pas (mortes)
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence
Applications (2)
Immunofluorescence
caractéristiques:
Anticorps spécifiques à protéine ou organisme
-> couplage anticorps - fluorochromes –> détection
par fluorescente
solution avec anticorp-fluorochrome dans solution
se lie à sa cellule cible = fluorescence
peut détecter pathogènes -> clinique ou environne.
limite : sensibilité Anticorps
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence
Applications
Immunofluorescence
Détection spécifique espèce comment suite à anticorp-fluorochrome lié à cible?
Avantages + limites?
- Hybridation fluorescente in situ (FISH)
- Sonde ADN fluorescentes spécifiques
– différents fluorochromes = différentes espèces - Quantification, analyse informatique
Avantages:
- pas besoin faire culture (<0,1% microorg se cultivent)
Limites: mise au point -> spécificité
diffusion de la sonde
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Quels sont les 2 types de microscopes électroniques?
À transmission (passe à travers)
À balayage (balayé, surfaces)
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
- Quand a été sa 1ière utilisation?
- Qui l’a inventé? Nobel?
- taille microorg ?
- 1931
- Ruska, Nobel 1986
- Visualisation microorganisme très petits (nm)
Différences Agrandissement microscope photonique et microscope électronique?
photonique: 1000x
électronique: 400 000x
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Composantes du microscopes:
condensateur, objectif, oculaire
+ électro-aimants
+ lentilles magnétiques
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Comment visualiser le résultat/image?
écran fluorescents
plaque photographique
détecteur numérique
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Quelles sont les limites?
- les é voyagent dans le vide!
- doit avoir vide dans microscope (pompe)
- matériel non-vivant!
–> matériel vivant = non électron dense (passe dans discrimination) -> diminue contraste - é sont non pénétrants! (ne traversent pas quelque chose
moindrement épais)
- coupes très fines!
- imprégnation –> altérations?
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Il y a t il une “coloration”? si oui, quel type général?
OUI
“coloration” par métaux imperméables aux électrons:
(Pas couleur)
- métaux: fer, or, uranium, lanthane
- acide phosphotungstique
quand é absorbés = image noire
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”
Quelles sont-elles?
- Technique d’ombrage (shadow casting)
- Coloration négative
- Cyodécapage (freeze etching / fracture)
- Immuno-localisation cellulaire
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”
Principes: technique d’ombrage (shadow casting)
vaporisation à angle précis, recouvre échantillon
–> ombre
Billes témoins qui ont taille définies
–> on compare les ombre
–> détermination d’élévation
creux: n’absorbent pas métaux
protubérant: absorbent métaux
métaux absorbent é –> image noire
- Peut suivre la technique de cyodécapage
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”
Principes: Coloration négative
Acide phsphotungstique
Accumulation dans les creux
creux = foncés
protubérances = claires
- peut voir relief et structure (ex: virus)
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”
Principes: Cyodécapage (freeze etching/fracture)
congléation ToC -180oC
échantillon fixé
coupes transversales aux zones de faiblesse de la cellule
Suivi de la technique d’ombrage
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”
Principes: Immuno-localisation cellulaire
- anticorps spécifique à protéine / structure
- coulage anticorps-billes Fe ou Au (métal, absorbe é,
noir) - permet localiser structure ou protéine spécifique dans
cellule
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
(2) Types de microscopes
À transmission
ce qui arrive aux é?
où est le détecteur?
qu’arrive-t-il avec la limite de résolution?
Effet (2D ou 3D)
- é traverse échantillon
- détecteur sous échantillon
-> image par “transparence” (voit au travers) - limite de résolution diminue!
- Effet 2D
structures fines
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
(2) Types de microscopes
À balayage
ce qui arrive aux é?
où est le détecteur?
qu’arrive-t-il avec la limite de résolution?
Effet (2D ou 3D)
Balayage de la surface de l’échantillon
- é réfléchit (ce que l’on observe)
- Détecteur latéral
- limite de résolution augmente
- effet 3D
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Progrès microscopes électroniques à transmission
Quels sont les 2 types de microscope?
cryoélectromicroscopie (cryo-EM)
cryotomographie électronique
MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Progrès microscopes électroniques à transmission
Principes:
- cryoélectromicroscopie (cryo-EM)
- cryotomographie électronique
Cryoélectromicroscopie (cryo-EM)
- modélisation structures protéines + structures
- protéine “Spike”
- Ex: SARS-Cov2-ACE2
cryotomographie électronique
- tomographie: images de strates de l’échantillon
- sans produire coupure
- reconstruction informatique 3D
-> congélation rapide -135oC
(éthane + N2 liquide)
-> Vitrification de l’eau (pas cristaux, manière
amorphe)
-> conserve intégrité des structures sous-vide
(microsc. élec)
-> structures mieux définies
==> avancées importantes dans visualisation structures + organisme
- Amélioration constante
AUTRES MICROSCOPES
2 types?
- Microscope confocal à balayage laser (photonique)
- Microscope à balayage de sonde
AUTRES MICROSCOPES
Principes microscope confocal à balayage laser (photonique)
- illumination par laser (UV)
- utilisation de fluorochromes –> fluorescense
- exclusivement plan foyer (couche précise)
- élimine fluorescence des autres plans
- augmente contraste, diminue interférence
- Balayage laser(3D) : horizontal, vertical, temporel (4D)
- Numérisation image
- reconstruction + quantification informatique
- Applications:
- Détection ou localisation structure dans cellule, tissu,
etc. - Développement biofilm vs temps
- Quantification + position cellules vivantes + mortes
- Détection ou localisation structure dans cellule, tissu,
AUTRES MICROSCOPES
Microscope à balayage de sonde
2 types:?
À effet tunnel
À force atomique
AUTRES MICROSCOPES
Microscope à balayage de sonde
Microscope à effet tunnel
Créateur, nobel?
Sonde fait quoi?
Grossissement?
Rohrer et Bining –> Nobel 1986
sonde balaie surface
-> mesure déplacement vertical/horizontal et le courant entre les nuages électroniques
Grossissement 10^8
Liens intermoléculaires
Observation en milieu aqueux
AUTRES MICROSCOPES
Microscope à balayage de sonde
Microscope à force atomique
Déplace sonde effilée à surface échantillon en maintenant constante distance entre pointe sonde et surface
mouvement verticale pointe suivi par mesure déflexion rayon laser envoyé sur levier portant sonde
Étude de surface ne conduit pas bien électricité
- étude interactions protéine-protéine, suivre comportement bactéries, et cell vivantes et visualier protéines memebranaires ex aquaporines
Nanotechnologies
Biomatériaux
Perception plus précise des structures vivantes et des matériaux
