Observation microscopique des microorganismes

Question 1

Quels sont les 2 grands types de microscopes et quels sont les longueurs d’ondes observées par chaque?

Answer 1

Photonique: um
Électronique: nm

Question 2

Quelles sont les différences majeures entre le microscope photonique et le microscope électronique?

Answer 2

Les particules bombardées sur l’échantillon et le grossissement

Question 3

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Le système de lentille est composé de: (3)?

Answer 3

Condensateur (entre source lumineuse et échantillon)
Objectif (1er système de lentille, agrandit 1ère fois)
Oculaire (près oeil, agrandit 2ième fois)

Question 4

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Qu’est-ce que la limite de résolution?

Answer 4

Distance minimale entre deux points qui peuvent être perçus comme distincts.

Question 5

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution: λ / (2nsinØ)
Que signifie chaque composante?

Answer 5

λ: longueur d’onde
n: indice réfraction (change selon milieu)
Ø: 1/2 de l’angle du cône de lumière entrant dans objectif

nsinØ = Ouverture numérique = prédéfinit => écrit sur l’objectif ex: 0,90
LR = 0,21 u (centre spectre électromagn)
lumière blanche: 0,2 u
meilleurs microscope: 0,1 u
- violet : augmente limite résol
- rouge: diminue limite résol

Question 6

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution:
Facteurs où l’on peut intervenir = λ
–> comment?

Answer 6

(λ, n et Ø)
λ: longueur d’onde
- visible = 400 à 700 nm
- ultraviolet = 180 à 400 nm (ce qu’on voudrait voir)
problème UV: verre = opaque aux UV –> quartz$
à l’extérieur du visible
transformation optique
sécurité –> nocif pour yeux

Question 7

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution:
Quels sont les 3 facteurs où l’on peut intervenir?

Answer 7

λ, n et Ø

Question 8

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution:
Facteurs où l’on peut intervenir = n
–> comment?

Answer 8

(λ, n et Ø)
n: indice de réfraction du milieu: identifié sur objectif
- déviation de la lumière entre échantillon et 1er
système de lentille
- n air: 1,0
verre: 1,5
huile à immersion: 1,56 –> diminue déviation
—> diminue limite de résolution
–> sur objectif à fort grossissement : 50 - 100x

Question 9

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Limite de résolution:
Facteurs où l’on peut intervenir = Ø
–> comment?

Answer 9

(λ, n et Ø)
Ø: 1/2 de l’angle du cône de lumière entrant dans
objectif
- + angle est grand, + limite de résolution = faible

Question 10

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Qu’est-ce que le contraste?

Answer 10

Capacité à distinguer une structure de son environnement
–> proportionnel à la différence de quantité de lumière absorbée
–> structure vs milieu

Question 11

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond clair
Caractéristiques:
aspects structure + fond?
Préparation, cellules vivantes ou mortes
coloration?

Answer 11

• structures sombres sur fond clair
• préparation à l’état frais! cell vivantes!
  - morphologie, motilité, division cell., corps
  inclusion cytopl.
  —> diminue contraste
  Comment augmenter contraste? COLORATION

Question 12

VRAI ou FAUX
MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond clair
Un lame ayant subit une coloration peut présenter des organismes morts ou vivants

Answer 12

FAUX
organismes morts seulement!
Existe peu de colorant vitaux
Exige fixation + coloration –> réarrangement
morphologie

Colorants =
- hydrophobes (ex membrane lipidique)
- chargés + ou - (ex organisme absorbe lumière,
coloré sur fond clair)

Question 13

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond clair
Quels sont les 2 classes de coloration qui existe pour colorer lame? + développer

Answer 13

Coloration simple :
1 seul colorant ex: bleu de méthylène (+),
colorant uniforme
Coloration différentielle:
2 types:
- Gram
- AAR (Alcoolo-acido-résistance)
Ziehl Nelson

Question 14

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond clair
Quels sont les 2 types de coloration différentielles?

Sur quelles bases cette coloration fonctionne-t-elle?

Answer 14

!Coloration de Gram:
Gram + : retient cristal violet (violet) <400nm
Gram - : ne retient pas cristal violet (rouge)
>700nm

   Dépend structures parois bactéries
   Discrimine grands groupes microbiens
   Capacité certaines cellules retenir pigment 
   spécifique

!AAR (Alcoolo - acido - résistance):
But: savoir si contient mycobactéries
Rétention carbone-fusine
–> pigment retenu malrgé lavage acide et alcool

Discrimine:
- endospores
- capsules
- flagelles
- corps d’inclusion

Question 15

Quels sont les 5 types de microscopes photoniques?

Answer 15

1. Microscope à fond clair
2. Microscope à fond noir
3. Microscope à contraste de phase
4. Microscope à contraste d’interférence différentielle
5. Microscope à (épi)fluorescence

Question 16

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond noir

Quelles sont les différences avec microscope fond clair?

Answer 16

presque identique à fond clair mais:

pas besoin fixation
pas besoin coloration
Différence dans condensateur:
- cône de Abbe + miroirs
- éclairage oblique
- visualisation rayons déviés

Question 17

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à fond noir

Caractéristiques:
Fixation? coloration?
cellules vivantes ou mortes?
Altérations?
Intérieur microscope?
Ce que l’on voit?
différences dans condensateur?

Answer 17

pas besoin fixation
pas besoin coloration
cellules vivantes (état frais)
pas crainte altération
cône opaque dans condensateur + miroir oblique
structures claires sur fond noir
Différence dans condensateur:
- cône de Abbe + miroirs
- éclairage oblique
- visualisation rayons déviés (fond noir: ne dévit pas
la lumière)

Question 18

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste de phase
Qu’est-il possible de voir sur image?

Answer 18

halo autour de l’image
Images sombres sur fond clair (filtres coloré)

Question 19

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste de phase

Caractéristiques:
Extérieur?
Différences internes?
principe?
qui l’a découvert + Nobel?
Que voit-on?
Coloration? fixation?

Answer 19

Extérieur ressemble à fond clair
Différences internes: condensateurs et objectifs –>
Anneaux de phase (lumineuse)
Principes: mise en phase de la lumière incidente
Réfraction lumière par les structures cellulaires =
changement de phase de la lumière = changement
intensité lumière
Zernicke Nobel 1953
Structures de densité différentes (contraste intensifié)
- réfractions différentes
- intensités lumineuses différentes
Images sombres sur fond clair –> filtres colorés
Visualisation de structures fines sans coloration ni
fixation –> cellules vivantes

Toute la lumière qui arrive = mise en phase (unifromisée) –> crête + creux s’annulent

Question 20

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste d’interférence différentielle

caractéristique ce que l’on voit?

Answer 20

pseudo-relief 3D
Pas de halo de diffraction (contraste de phase)

Question 21

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste d’interférence différentielle

Qui l’a inventé?
différences avec les autres?

Answer 21

Nomarski
- lumière polarisée à angle variable
- réfractions différentes –> modification polarisation
- intensités lumineuses différentes

coloration vive + impression pseudorelief 3D

Question 22

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste d’interférence différentielle

Différence avec autres microscopes (objet)?

Answer 22

système lentilles polarisantes controlés par infromatique

Question 23

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à contraste d’interférence différentielle

Qu’est-ce qu’on visualise?
coloration? fixation?
limites?

Answer 23

structures fines
sans coloration ni fixation
limite = préparations transparentes

Question 24

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence

colorants?
principe?

Answer 24

colorants fluorescents (fluorochromes)
Absorption UV -> émission visible
- lampe UV: excitatrice
- Filtre sélectif (bloquant)
- Observations (visible)

UV passe dans quartz -> objet -> réflexion visible -> visible réfléchit dans le verre –> oeil

Question 25

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence

Quelles sont ses différentes applications?

Answer 25

• Fluorochromes vitaux
• Immunofluorescence

Question 26

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence
Application (2)

Fluorochromes vitaux

Answer 26

Distinction cellules vivantes et cellules mortes

vivantes: (verte) exclusion membrane cytoplasmique
(imperméable)
mortes: (rouge) membrane cytoplasmique =
perméable

• différence dans longueur d’onde absorbée

énumération différentielle par logiciel d’analyse d’image

Exemple but: savoir quelles cellules peuvent faire cultures (vivantes) et quelles ne peuvent pas (mortes)

Question 27

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence
Applications (2)

Immunofluorescence
caractéristiques:

Answer 27

Anticorps spécifiques à protéine ou organisme
-> couplage anticorps - fluorochromes –> détection
par fluorescente

solution avec anticorp-fluorochrome dans solution
se lie à sa cellule cible = fluorescence

peut détecter pathogènes -> clinique ou environne.
limite : sensibilité Anticorps

Question 28

MICROSCOPE PHOTONIQUE
Microscope à (épi) fluorescence
Applications

Immunofluorescence
Détection spécifique espèce comment suite à anticorp-fluorochrome lié à cible?

Avantages + limites?

Answer 28

• Hybridation fluorescente in situ (FISH)
• Sonde ADN fluorescentes spécifiques
  – différents fluorochromes = différentes espèces
• Quantification, analyse informatique

Avantages:
- pas besoin faire culture (<0,1% microorg se cultivent)
Limites: mise au point -> spécificité
diffusion de la sonde

Question 29

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE

Quels sont les 2 types de microscopes électroniques?

Answer 29

À transmission (passe à travers)
À balayage (balayé, surfaces)

Question 30

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE

1. Quand a été sa 1ière utilisation?
2. Qui l’a inventé? Nobel?
3. taille microorg ?

Answer 30

1. 1931
2. Ruska, Nobel 1986
3. Visualisation microorganisme très petits (nm)

Question 31

Différences Agrandissement microscope photonique et microscope électronique?

Answer 31

photonique: 1000x
électronique: 400 000x

Question 32

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Composantes du microscopes:

Answer 32

condensateur, objectif, oculaire
+ électro-aimants
+ lentilles magnétiques

Question 33

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Comment visualiser le résultat/image?

Answer 33

écran fluorescents
plaque photographique
détecteur numérique

Question 34

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Quelles sont les limites?

Answer 34

• les é voyagent dans le vide!
  - doit avoir vide dans microscope (pompe)
  - matériel non-vivant!
  –> matériel vivant = non électron dense (passe dans discrimination) -> diminue contraste
• é sont non pénétrants! (ne traversent pas quelque chose
  moindrement épais)
  - coupes très fines!
  - imprégnation –> altérations?

Question 35

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Il y a t il une “coloration”? si oui, quel type général?

Answer 35

OUI
“coloration” par métaux imperméables aux électrons:
(Pas couleur)
- métaux: fer, or, uranium, lanthane
- acide phosphotungstique

quand é absorbés = image noire

Question 36

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”
Quelles sont-elles?

Answer 36

• Technique d’ombrage (shadow casting)
• Coloration négative
• Cyodécapage (freeze etching / fracture)
• Immuno-localisation cellulaire

Question 37

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”

Principes: technique d’ombrage (shadow casting)

Answer 37

vaporisation à angle précis, recouvre échantillon
–> ombre
Billes témoins qui ont taille définies
–> on compare les ombre
–> détermination d’élévation
creux: n’absorbent pas métaux
protubérant: absorbent métaux

métaux absorbent é –> image noire

• Peut suivre la technique de cyodécapage

Question 38

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”

Principes: Coloration négative

Answer 38

Acide phsphotungstique
Accumulation dans les creux
creux = foncés
protubérances = claires
- peut voir relief et structure (ex: virus)

Question 39

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”

Principes: Cyodécapage (freeze etching/fracture)

Answer 39

congléation ToC -180oC
échantillon fixé
coupes transversales aux zones de faiblesse de la cellule

Suivi de la technique d’ombrage

Question 40

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Techniques de préparation/ “coloration”

Principes: Immuno-localisation cellulaire

Answer 40

• anticorps spécifique à protéine / structure
• coulage anticorps-billes Fe ou Au (métal, absorbe é,
  noir)
• permet localiser structure ou protéine spécifique dans
  cellule

Question 41

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
(2) Types de microscopes

À transmission
ce qui arrive aux é?
où est le détecteur?
qu’arrive-t-il avec la limite de résolution?
Effet (2D ou 3D)

Answer 41

• é traverse échantillon
• détecteur sous échantillon
  -> image par “transparence” (voit au travers)
• limite de résolution diminue!
• Effet 2D

structures fines

Question 42

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
(2) Types de microscopes

À balayage
ce qui arrive aux é?
où est le détecteur?
qu’arrive-t-il avec la limite de résolution?
Effet (2D ou 3D)

Answer 42

Balayage de la surface de l’échantillon
- é réfléchit (ce que l’on observe)
- Détecteur latéral
- limite de résolution augmente
- effet 3D

Question 43

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Progrès microscopes électroniques à transmission

Quels sont les 2 types de microscope?

Answer 43

cryoélectromicroscopie (cryo-EM)
cryotomographie électronique

Question 44

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Progrès microscopes électroniques à transmission
Principes:
- cryoélectromicroscopie (cryo-EM)
- cryotomographie électronique

Answer 44

Cryoélectromicroscopie (cryo-EM)
- modélisation structures protéines + structures
- protéine “Spike”
- Ex: SARS-Cov2-ACE2

cryotomographie électronique
- tomographie: images de strates de l’échantillon
- sans produire coupure
- reconstruction informatique 3D

-> congélation rapide -135oC
(éthane + N2 liquide)
-> Vitrification de l’eau (pas cristaux, manière
amorphe)
-> conserve intégrité des structures sous-vide
(microsc. élec)
-> structures mieux définies

==> avancées importantes dans visualisation structures + organisme
- Amélioration constante

Question 45

AUTRES MICROSCOPES
2 types?

Answer 45

• Microscope confocal à balayage laser (photonique)
• Microscope à balayage de sonde

Question 46

AUTRES MICROSCOPES
Principes microscope confocal à balayage laser (photonique)

Answer 46

• illumination par laser (UV)
• utilisation de fluorochromes –> fluorescense
  
  • exclusivement plan foyer (couche précise)
  • élimine fluorescence des autres plans
  • augmente contraste, diminue interférence
• Balayage laser(3D) : horizontal, vertical, temporel (4D)
• Numérisation image
  
  • reconstruction + quantification informatique
• Applications:
  
  • Détection ou localisation structure dans cellule, tissu,
    etc.
  • Développement biofilm vs temps
  • Quantification + position cellules vivantes + mortes

Question 47

AUTRES MICROSCOPES
Microscope à balayage de sonde

2 types:?

Answer 47

À effet tunnel
À force atomique

Question 48

AUTRES MICROSCOPES
Microscope à balayage de sonde

Microscope à effet tunnel
Créateur, nobel?
Sonde fait quoi?
Grossissement?

Answer 48

Rohrer et Bining –> Nobel 1986
sonde balaie surface
-> mesure déplacement vertical/horizontal et le courant entre les nuages électroniques
Grossissement 10^8
Liens intermoléculaires
Observation en milieu aqueux

Question 49

AUTRES MICROSCOPES
Microscope à balayage de sonde

Microscope à force atomique

Answer 49

Déplace sonde effilée à surface échantillon en maintenant constante distance entre pointe sonde et surface

mouvement verticale pointe suivi par mesure déflexion rayon laser envoyé sur levier portant sonde

Étude de surface ne conduit pas bien électricité
- étude interactions protéine-protéine, suivre comportement bactéries, et cell vivantes et visualier protéines memebranaires ex aquaporines

Nanotechnologies
Biomatériaux
Perception plus précise des structures vivantes et des matériaux