Nukleinsav izolálás

Question 1

Nukleinsav izolálás lépései

Answer 1

Kivonás, Tisztíts, Elválasztás

Question 2

Mi jellemző a foszfolipidekre?

Answer 2

Amfipatikusak

Question 3

Mi a detergens?

Answer 3

Kémiai ágens, amfipatikusak

Question 4

Hogyan hat a detergens a membránra?

Answer 4

Kevert micellák alakulnak ki

Question 5

Mit csinál az SDS?

Answer 5

Mindent denaturálva tart, tönkreteszi a foszfolipidréteget

Question 6

Mikre érzékeny a DNS?

Answer 6

Mechanikai behatás ( vortx, pipetta)

Enzim (DNáz)

Question 7

DNS minta kezelése

Answer 7

pH optimum: 7,5-8,0

Tárolási hőmérséklet: 4C-genomiDNS, -20C- plazmid DNS

Question 8

Milyen károsodás történik pH változásnál?

Answer 8

ph<5,5- depurinálás, szálak törnek

ph>10- szálak szétválnak

Question 9

Milyen károsodás történik UV sugárzás hatására?

Answer 9

Lambda<300nm- szálak hasadnak, keresztkötések bázisok között

Question 10

Genomi DNS tisztításának lépései

Answer 10

1, Sejtek előkészítése
2, Lízis és emésztés
3, Extrahálás (fehérjék eltávolítása)
4, Etanol kicsapás
5, Szárítás és a DNS feloldása TE pufferben
6, Tárolás

Question 11

Lízis és emésztés lépései

Answer 11

1, Szövet,sejtkultúra homogenizálása
2, Homogenizátum szuszpendálása emésztő pufferben
3, Inkubálás 50C-on 1-2 óráig

Question 12

Sejtek előkészítésének módjai

Answer 12

Teljes szövet: gyors izolálás, aprítás, fagyasztás

Sejtkultúra: puffer csere, hűtés, fagyasztás

Question 13

Emésztő puffer mit tartalmaz?

Answer 13

HCl (ph8), EDTA (DNázok gátlása), SDS(proteinek denaturálása), proteináz K

Question 14

Extrahálás lépései

Answer 14

1, Azonos térfogatú fenol/kloroform/izoamilalkohol hozzáadása az oldathoz
2, Óvatos keverés
3, Centrifugálás 5000g, 10 perc
4, Felső vizes fázis eltávolítása (ebben van a DNS)
5, Extrahálás ismétlése ha kell

Question 15

Etanol kicsapásnál mi történik

Answer 15

DNS koncentrálása, maradék fenol és kloroform eltávolítása, az RNS mennyiség csökkentése, a kicsapott DNS hosszú tapadós fehér szálakat alkot

NH4-acetát,etanol hozzáadás,centrifuga,csapadék mosása etanollal

Question 16

Fenol és izoamilalkohol feladata

Answer 16

Fenol és kloroform kicsapja a fehérjéket, a másik gátolja a habképződést

Question 17

Adszorpciós kromatográfián alapuló módszer lépései

Answer 17

1, Sejtek feltárása kivonó pufferrel ( alacsony pH, nagy ionerősség,kaotróp sók)
2, DNS adszorbeálása Szilika-gél felszínén: nukleinsav kötődni fog a szennyező átfolyik
3, Maradék szennyező mosása: mosópuffer
4, Nukleinsav eluálás: eluáló puffer (magas pH, alacsony ionerősség)

Question 18

Ion-cserés kromatográfia lényege

Answer 18

Nagy tisztaságú DNS kivonás, különböző töltéssel rendelkező molekulákat választja el töltésük szerint

Question 19

Hol szaporítható a plazmid?

Answer 19

Folyékony kultúrában

Question 20

Plazmid DNS izolálása

Answer 20

1, Lízis SDS-sel, DNS denaturálása NaOH-dal
2, Lízátum pH semlegesítése: plazmid DNS oldatban marad
3, Kivált csapadéktól DNS elválasztása centrifugával

Question 21

Mikor mondható tisztának a DNS?

Answer 21

Ha A260/A280>1,8

Question 22

RNS izolálás lépései

Answer 22

1, Minta homogenizálása denaturáló pufferben (guanidin tiocianát, Na-citrát-pH7, 2-merkaptoetanol, N-laurilszarkozin)
2, +0,1 térfogat Na-acetát, ph4
3, +1 térfogat vízzel telített fenol
4, +0,2 térfogat 49:1 kloroform/izoamilalkohol
5, Inkubálás 0C-on 15 percig
6, Centrifugálás 10000 g 20 perc (felső vízes fázisban RNS)
7, RNS kicsapása izopropil alkohollal
8, Csapadék mosása etanollal
9, Szárítás, RNS felszuszpendálása etanolban
10, Tárolás -70C-on

Question 23

Milyen módszerrel izolálható mRNS?

Answer 23

Oligo(dT) affinitás kromatográfia

Question 24

Mit határoz meg az agaróz gél koncntrációja?

Answer 24

Hogy milyen mérettartományú DNS molekulákat tudunk elválasztani
Kisebb konc- nagyobb DNS
Nagyobb konc- kisebb DNS