DNS klónózás, nukleinsav könyvtárak

Question 1

Mi a klónózó vektor?

Answer 1

Olyan DNS molekula, amelybe idegen DNS fragmentum (inzert) építhető be

Question 2

Mi a rekombináns vektor?

Answer 2

idegen DNS inzertet tartalmazó vektor DNS. A

vektor és az inzert kovalensen összekapcsolva

Question 3

Mit tartalmaz a klónózó vektor?

Answer 3

replikációs origót (ori)
MCS – többszörös klónozó hely az inzert beillesztéséhez
promoter
szelekciós marker

Question 4

Mire van szükség DNS klónózáshoz?

Answer 4

1. a klónozni kívánt DNS
2. megfelelő vektor a klónozandó DNS
   befogadására, megfelelő gazdasejtben
   történő replikációjára
3. restrikciós enzimek a vektor és DNS
   előkészítésére
4. DNS ligáz
5. gazdasejt

Question 5

Honnan származhat a klónozandó DNS?

Answer 5

genomi DNS, cDNS – reverz transzkripcióval mRNS templátról, szintetikus DNS, amplifikált DNS

Question 6

Mi a vektor feladata?

Answer 6

Inzert befogadása
idegen DNS-ről fehérje átírás
képes legyen replikálódni és sejtosztódás során az
új sejtbe bekerülni

Question 7

Klónozó vektorok típusai?

Answer 7

plazmid
lambda bakteriofág
kozmid vektor

Question 8

Plazmid jellemzői

Answer 8

extrakromoszomális
önálló replikációra képes
cirkuláris
inzert méret: 5kb

Question 9

Lambda bakteriofág jellemzői

Answer 9

lineáris
nagyobb hatékonyság
inzert méret 15 kb
lehet inzerciós vagy kicserélő

Question 10

Kozmid vektor jellemzői

Answer 10

a plazmid és a λ fág kombinációja
inzert méret 40 kb
Kozmid DNS gyűrűvé záródik és plazmidként replikálódik

Question 11

DNS klónózás fő lépései

Answer 11

1, A rekombináns vektor konstrukciójának létrehozása
2, A rekombináns vektor gazdasejtbe juttatása
3, A rekombinánst tartalmazó sejt szelektív tenyésztése
4, A rekombináns izolálása és jellemzése

Question 12

Hogy hozunk létre rekombináns vektort?

Answer 12

1, A vektor és a klónozandó DNS molekula komplementer végeinek kialakítása -> azonos restrikciós enzim
2, Az inzert és a lineáris vektor ligálása

Question 13

Milyen más termék keletkezhet ligálás során? Hogyan küszöbölhető ki? Hogyan nevezzük ezt?

Answer 13

vektor önligálódik az inzert nélkül
az inzertek ligálódnak
Kiküszöbölés: 1. Az emésztett vektor 5’ végein foszfát csoport található, ezt eltávolítjuk, a ligáz nem képes a két végét egymással összekapcsolni
2. A rekombináns vektor konstrukció létrehozásához különböző restrikciós enzimeket használunk fel

-> IRÁNYÍTOTT LIGÁLÁS

Question 14

Mi a transzformálás?

Answer 14

Amikor egy rekombináns plazmidot gazdasejtbe ˙(E. coli-ba) juttatunk

Question 15

Hogy lehet kompetenssé tenni egy sejtet?

Answer 15

Kémiailag: inkubálás->hősokk->regenerálás
Sókezelés (CaCl2)
Elektroporáció: inkubálás->elektrosokk->regenerálás

A plazmid és a kompetens sejt elegyét inkubáljuk együtt!

Question 16

MI történik a lineáris DNS-sel baciban?

Answer 16

Degradálódik

Question 17

Hol tudnak hatni az antibiotikumok?

Answer 17

Sok helyen pl. nukleinsav szintézis gátlás, sejtfal szintézis gátlás

Question 18

Hogy választhatjuk ki a rekombinánst?

Answer 18

LacZ gén felhasználása: ß-galaktozidázt kódol
Az inzertet a β-galaktozidáz enzim egyik alegységének génjének közepébe integráljuk -> nem képződik működő enzim-> nem hasítja az X-galt a táptalajban ->fehér telep lesz nem kék

Question 19

Lehetséges-e egyszerre több DNS fragmentum klónozása?

Answer 19

Igen, mindegyik rekombináns plazmid más inzertet fog tartalmazni

Question 20

Mi a DNS könyvtár?

Answer 20

Reprezentatív DNS fragmentumok önreplikációra képes vektorba klónozott gyűjteménye, amely megfelelő gazdasejtben szaporítható.

Question 21

Milyen típusai vannak a DNS könyvtárnak?

Answer 21

• genomi könyvtárak

* cDNS könyvtárak

Question 22

Mi a cDNS?

Answer 22

Az RNS molekulából készítünk DNS-t reverz transzkriptáz enzim segítségével. Az így készült DNS kópiát nevezzük cDNS-nek.
A cDNS alkalmas baktériumsejtekben való rekombináns fehérjetermeltetésre is.

Question 23

Alkalmazható az RNS klónózásra?

Answer 23

Nem, instabil, bomlékony

Question 24

Azonos a genomi és cDNS könyvtárak tartalma?

Answer 24

Nem, mivel a genomiban benne van az intron is de a cDNS-ben csak az exon

Question 25

Genomi könyvtár készítés

Answer 25

``` 1. DNS izolálás 2, DNS és plazmid hasítás res. enzimmel 3, Ligálás (DNS ligáz) 4, DNS amplifikáció 5, DNS izolálás ```

Question 26

cDNS könyvtár készítés

Answer 26

``` 1, mRNS-ről reverz transzkriptázzal cDNS készítés 2, DNS és plazmid hasítás res. enzimmel 3, Ligálás 4, Amplifikáció gyorsan osztódó baciban 5, Izolálás ```

Question 27

Fág lítikus ciklusa

Answer 27

1, Fág beinjektálja gazdába a DNS-t 2, Fág DNS cirkularizálódik 3, Új fág DNS és fehérjék szintézise, összeépülés virionná 4, Sejt lízis, fágok kiszabadulnak

Question 28

Fág lizogén ciklusa

Answer 28

1, Fág beinjektálja gazdába a DNS-t 2, Fág DNS cirkularizálódik 3, Fág DNS rekombinációval integrálódik a gazda DNS-be->profág lesz belőle 4, Lizogén baci normál módon osztódik 5, Néha a profág kivágódik a genombol és lítikus ciklusba kezd

Question 29

Mi a DNS könyvtárszűrés?

Answer 29

Nagyszámú rekombináns klón közül egyetlen, a minket érdeklő klón kiválasztása