DNS klónózás, nukleinsav könyvtárak

Question 1

Mi a klónózó vektor?

Answer 1

Olyan DNS molekula, amelybe idegen DNS fragmentum (inzert) építhető be

Question 2

Mi a rekombináns vektor?

Answer 2

idegen DNS inzertet tartalmazó vektor DNS. A

vektor és az inzert kovalensen összekapcsolva

Question 3

Mit tartalmaz a klónózó vektor?

Answer 3

replikációs origót (ori)
MCS – többszörös klónozó hely az inzert beillesztéséhez
promoter
szelekciós marker

Question 4

Mire van szükség DNS klónózáshoz?

Answer 4

1. a klónozni kívánt DNS
2. megfelelő vektor a klónozandó DNS
   befogadására, megfelelő gazdasejtben
   történő replikációjára
3. restrikciós enzimek a vektor és DNS
   előkészítésére
4. DNS ligáz
5. gazdasejt

Question 5

Honnan származhat a klónozandó DNS?

Answer 5

genomi DNS, cDNS – reverz transzkripcióval mRNS templátról, szintetikus DNS, amplifikált DNS

Question 6

Mi a vektor feladata?

Answer 6

Inzert befogadása
idegen DNS-ről fehérje átírás
képes legyen replikálódni és sejtosztódás során az
új sejtbe bekerülni

Question 7

Klónozó vektorok típusai?

Answer 7

plazmid
lambda bakteriofág
kozmid vektor

Question 8

Plazmid jellemzői

Answer 8

extrakromoszomális
önálló replikációra képes
cirkuláris
inzert méret: 5kb

Question 9

Lambda bakteriofág jellemzői

Answer 9

lineáris
nagyobb hatékonyság
inzert méret 15 kb
lehet inzerciós vagy kicserélő

Question 10

Kozmid vektor jellemzői

Answer 10

a plazmid és a λ fág kombinációja
inzert méret 40 kb
Kozmid DNS gyűrűvé záródik és plazmidként replikálódik

Question 11

DNS klónózás fő lépései

Answer 11

1, A rekombináns vektor konstrukciójának létrehozása
2, A rekombináns vektor gazdasejtbe juttatása
3, A rekombinánst tartalmazó sejt szelektív tenyésztése
4, A rekombináns izolálása és jellemzése

Question 12

Hogy hozunk létre rekombináns vektort?

Answer 12

1, A vektor és a klónozandó DNS molekula komplementer végeinek kialakítása -> azonos restrikciós enzim
2, Az inzert és a lineáris vektor ligálása

Question 13

Milyen más termék keletkezhet ligálás során? Hogyan küszöbölhető ki? Hogyan nevezzük ezt?

Answer 13

vektor önligálódik az inzert nélkül
az inzertek ligálódnak
Kiküszöbölés: 1. Az emésztett vektor 5’ végein foszfát csoport található, ezt eltávolítjuk, a ligáz nem képes a két végét egymással összekapcsolni
2. A rekombináns vektor konstrukció létrehozásához különböző restrikciós enzimeket használunk fel

-> IRÁNYÍTOTT LIGÁLÁS

Question 14

Mi a transzformálás?

Answer 14

Amikor egy rekombináns plazmidot gazdasejtbe ˙(E. coli-ba) juttatunk

Question 15

Hogy lehet kompetenssé tenni egy sejtet?

Answer 15

Kémiailag: inkubálás->hősokk->regenerálás
Sókezelés (CaCl2)
Elektroporáció: inkubálás->elektrosokk->regenerálás

A plazmid és a kompetens sejt elegyét inkubáljuk együtt!

Question 16

MI történik a lineáris DNS-sel baciban?

Answer 16

Degradálódik

Question 17

Hol tudnak hatni az antibiotikumok?

Answer 17

Sok helyen pl. nukleinsav szintézis gátlás, sejtfal szintézis gátlás

Question 18

Hogy választhatjuk ki a rekombinánst?

Answer 18

LacZ gén felhasználása: ß-galaktozidázt kódol
Az inzertet a β-galaktozidáz enzim egyik alegységének génjének közepébe integráljuk -> nem képződik működő enzim-> nem hasítja az X-galt a táptalajban ->fehér telep lesz nem kék

Question 19

Lehetséges-e egyszerre több DNS fragmentum klónozása?

Answer 19

Igen, mindegyik rekombináns plazmid más inzertet fog tartalmazni

Question 20

Mi a DNS könyvtár?

Answer 20

Reprezentatív DNS fragmentumok önreplikációra képes vektorba klónozott gyűjteménye, amely megfelelő gazdasejtben szaporítható.

Question 21

Milyen típusai vannak a DNS könyvtárnak?

Answer 21

• genomi könyvtárak

* cDNS könyvtárak

Question 22

Mi a cDNS?

Answer 22

Az RNS molekulából készítünk DNS-t reverz transzkriptáz enzim segítségével. Az így készült DNS kópiát nevezzük cDNS-nek.
A cDNS alkalmas baktériumsejtekben való rekombináns fehérjetermeltetésre is.

Question 23

Alkalmazható az RNS klónózásra?

Answer 23

Nem, instabil, bomlékony

Question 24

Azonos a genomi és cDNS könyvtárak tartalma?

Answer 24

Nem, mivel a genomiban benne van az intron is de a cDNS-ben csak az exon

Question 25

Genomi könyvtár készítés

Answer 25

1. DNS izolálás
2, DNS és plazmid hasítás res. enzimmel
3, Ligálás (DNS ligáz)
4, DNS amplifikáció
5, DNS izolálás

Question 26

cDNS könyvtár készítés

Answer 26

1, mRNS-ről reverz transzkriptázzal cDNS készítés
2, DNS és plazmid hasítás res. enzimmel
3, Ligálás
4, Amplifikáció gyorsan osztódó baciban
5, Izolálás

Question 27

Fág lítikus ciklusa

Answer 27

1, Fág beinjektálja gazdába a DNS-t
2, Fág DNS cirkularizálódik
3, Új fág DNS és fehérjék szintézise, összeépülés virionná
4, Sejt lízis, fágok kiszabadulnak

Question 28

Fág lizogén ciklusa

Answer 28

1, Fág beinjektálja gazdába a DNS-t
2, Fág DNS cirkularizálódik
3, Fág DNS rekombinációval integrálódik a gazda DNS-be->profág lesz belőle
4, Lizogén baci normál módon osztódik
5, Néha a profág kivágódik a genombol és lítikus ciklusba kezd

Question 29

Mi a DNS könyvtárszűrés?

Answer 29

Nagyszámú rekombináns klón közül egyetlen, a minket érdeklő klón kiválasztása