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Bioaérosols et aérobiologie > Module 7: Méthodes d'analyse des échantillons de bioaérosols > Flashcards

Module 7: Méthodes d'analyse des échantillons de bioaérosols Flashcards

1
Q

Quelles sont les 6 catégories de méthodes d’analyse du contenu microbien des bioaérosols? Comment sont-elles développées?

A
  • Culture
  • Microscopie
  • Cytométrie en flux
  • Biologie moléculaire
  • Analyse chimique
  • Analyse biologique

Souvent dérivées des méthodes analytiques d’autres échantillons (ex. l’eau et le sol).

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Q

Vrai ou faux: il existe aucune méthode d’analyse universelle.

A

Vrai.

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3
Q

Pourquoi est-il difficile d’estimer le contenu microbien “total” dans l’analyse des bioaérosols?

A
  • Les micro-organismes dans l’air sont habituellement “stressés”
  • L’échantillonnage de l’air augmente le stress des microorganismes.
  • Chaque particule de bioaérosols contient une quantité variable de matériel biologique
  • Les microorganismes de dissocient difficilement de la particule aérosolisée
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4
Q

Quel est le stress principal lors de l’aérosolisation? Est-ce qu’il y a des micro-organismes qui peuvent y résister?

A

La déshydratation.
Les spores et les champignons peuvent y résister.
Certains additifs peuvent être ajoutés dans différents milieux afin d’augmenter la survie des bactéries.

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5
Q

Donnez une conséquence de la dissociation difficile des micro-organismes d’une particule aérosolisée. Donnez un exemple.

A

Il y a sous-évaluation des de la concentration réelle des micro-organismes.

Par exemple, il y a 5 bactéries dans une particule de bioaérosol, mais on compte seulement une colonie.

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6
Q

Bien que les concentrations de micro-organismes soient sous-estimées lors de la cuture, il y a une grande différence avec leur effet sur la santé. Expliquez cette limite.

A

Les effets sur la santé sont induits en proportion avec le contenu microbien. La dose d’exposition est plus grande que celle évaluée.

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7
Q

Expliquez comment les micro-organismes contenus dans les bioaérosols présentent un danger.

A

La vapeur contenue dans l’air des poumons peut réactiver les bioaérosols.

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8
Q

Décrivez l’état physiologique des micro-organismes dans les bioaérosols.

A
  • Cultivables ou non cultivables

- Viables ou non viables

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9
Q

Une culture n’est possible que si…

A
  • Les conditions de croissance sont connues
  • L’aérosolisation et l’échantillonnage n’ont pas nui à l’intégrité microbienne
  • Les voies métaboliques nécessaires à la croissance sont actives
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10
Q

Vrai ou faux: globalement, une grande proportion de la biodiversité microbienne est cultivable.

A

Faux.

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11
Q

Vrai ou faux: les micro-organismes de l’air se comportent différemment de leur équivalent non stressé et non endommagé.

A

Vrai.

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12
Q

Qu’est-ce qu’une conséquence des dommages subi par les microorganismes aérosolisés.

A

Ils sont plus sensibles aux biocides et aux agents sélectifs utilisés dans les milieux de culture.

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13
Q

Sur quoi dépend la récupération microbienne?

A
  • Des principes de fonctionnement et du design de l’échantillonneur
  • L’effet de l’échantillonneur sur a viabilité microbienne
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14
Q

Quels sont les deux types d’échantillonneurs utilisés?

A
  • Récupération sur une surface de collection (milieu de culture)
  • Récupérations dans une solution de collection
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15
Q

Vrai ou faux: il est très facile d’évaluer l’efficacité de l’échantillonneur à récupérer des bioaérosols.

A

Faux.

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16
Q

Comment standardisons-nous les échantillonneurs?

A
  • Génération et échantillonnage d’aérosols d’une concentration connue
  • Échantillonnage en utilisant parallèlement plusieurs échantillonneurs puis comparaison des différents échantillonneurs.
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17
Q

Expliquez pourquoi les différences liées à l’efficacité de récolte des micro-organismes peuvent engendrer des résultats erronés.

A

Les effets des échantillonneurs sur la viabilité des micro-organismes ne peuvent pas être différencié des problèmes de capture des bioaérosols.

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18
Q

Expliquez comment le temps d’échantillonnage affecte la survie des micro-organismes. Donnez des exemples d’échantillonneurs.

A

L’utilisation d’échantillonneurs pour une période prolongée augmente le stress sur les micro-organismes et réduit leur viabilité.

Andersen six étages
Barboteur AGI-30
Précipitateurs électrostatiques

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19
Q

Quelles sont les différentes méthodes d’analyse des échantillons par culture? Nommez leurs caractéristiques.

A
  • Échantillonnage directement sur un milieu de culture solide: aucune dilution n’est possible, temps d’échantillonnage en conséquence
  • Échantillonnage dans une solution de collection: dilutions possibles, étalement des dilutions sur un milieu de culture solide
  • Dilutions d’échantillons d’air, de surface ou de vrac avec un détergent: brise les agrégats, dilutions par facteur de 10
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20
Q

Quelles sont les caractéristiques d’un milieu de culture?

A
  • Contient les éléments indispensables à la croissance
  • Minimal (synthétiques) ou complexe (non-défini)
  • Solide ou liquide
  • Sélectif ou différentiel
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21
Q

Qu’est-ce que le rôle de l’amphotéricine B dans un milieu sélectif?

A

Inhibe la croissance des moisissures pour quantifier les bactéries.

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22
Q

Qu’est-ce que le rôle du chloramphénicol dans un milieu sélectif?

A

Inhibe la croissance des bactéries pour quantifier les moisissures.

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23
Q

Pourquoi évitons-nous, en général, les milieux sélectifs pour l’étude des bioaérosols?

A

Car le stress lié à l’aérosolisation et à l’échantillonnage diminue la cultivabilité des micro-organismes.

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24
Q

Quelles sont les cultures préférables pour la croissance des moisissures?

A
  • En présence d’un antibactérien

- Sabouraud-dextrose, rose-bengale, extrait de malt, DG18

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25
Q

Quelles sont les cultures préférables pour la croissance des bactéries?

A
  • En présence d’un antifongique

- Gélose tryptique de soya, R2A, gélose sang

26
Q

Quels sont les différents paramètres modifiables des conditions d’incubation?

A
  • La température d’incubation
  • Le temps d’incubation
  • La présence ou l’absence d’oxygène lors de l’incubation
27
Q

Sur quoi dépend la température d’incubation? Donnez des exemples.

A
  • Le type d’environnement et des sources possibles des micro-organismes recherchés.

Thermophiles: 50°C
Mésophiles: 37°C (pathogènes humains)
Organismes dans l’air (généralement): 18 à 25°C

28
Q

Donnez de exemples de temps d’incubation pour les différents micro-organismes suivants:
Bactéries
Mycobactéries
Actinomycètes et moisissures

A

Bactéries: 48 heures
Mycobactéries: 21 jours
Actinomycètes et moisissures: 7 jours

29
Q

Comment appelle-t-on les colonies sur un milieu de culture solides?

A

Unités formatrices de colonies (UFC)

30
Q

Quelle est la quantité maximale d’UFC par milieu de culture solide?

A

300 UFC pour les bactéries

50 UFC pour les moisissures

31
Q

Qu’est-ce que la méthode des trous positifs?

A
  • Une méthode de correction des comptes pour les impacteurs à multi-jets (ex. Andersen six étages)
  • Une zone d’impaction présentant de la croissance est susceptible d’être issue de plusieurs UFC
32
Q

Expliquez le fonctionnement de l’échantillonnage sur un filtre.

A
  • Élution des filtres
  • Dilutions en série dans de l’eau saline contenant un détergent
  • Étalements (100µL/milieu de culture solide)
    OU
  • Filtres en gélatine
  • Dépôt du filtre sur un milieu de culture solide
  • Dissolution du filtre dans de l’eau ou une solution tamponnée (ex. PBS)
  • Étalement des dilutions sériées sur des milieu de culture solide.
33
Q

Quels sont les trois niveaux d’identification des colonies isolées pour les bactéries?

A
  • Indentification sommaire (ex. coloration de Gram)
  • Galeries d’indentifications (galeries API, système VITEK)
  • PCR + séquençage de l’ADNr 16S
34
Q

Quels sont les niveaux d’identification des colonies isolées pour les moisissures?

A
  • Morphologie coloniale et microscopique
  • Clés d’indentification très simples ou complexes
  • PCR + séquençage de l’ITS (internal transcribing system)

Notez: la banque de données moins développée que celle pour les bactéries.

35
Q

Quelles sont les caractéristiques d’analyse sur microscope à fond clair?

A
  • Lame de microscope sur laquelle se sont impactés les bioaérosols OU échantillon liquide de bioaérosols déposé sur une lame (concentré ou non par filtration)
  • Détection et indentification de sores de moisissures et de grains de pollen
  • Utilisation de guides visuels
  • Nécessite une expertise
36
Q

Quelles sont les caractéristiques d’analyse sur microscope à contraste de phase?

A
  • Utilisé pour observer des bactéries à l’état frais (ex. observation de la motilité)
  • Observation des structures et des ornements à la surface des spores de moisissures
37
Q

Quelles sont les caractéristiques d’analyse sur microscope à fluorescence?

A
  1. Basée sur l’émission de fluorescence de molécules:
    - Excitation de molécules naturelles par lumière UV
    - Émission par des molécules excitées d’une lumière visible du ms.
  2. Utilisation de fluorochromes
    - L’orange d’acridine, le DAPI, le FITC
    - Peuvent être combinés avec ‘autres molécules (ex. anticorps)
    - Liaison spécifique des fluorochromes
  3. Permettent un contraste très fort
    - Seuls les molécules d’intérêt sont marquées avec une substance fluorescente et émettent la lumière.
38
Q

Quels sont les 4 types de marquage de fluorescence?

A
  • Marquage simple ou direct
  • Immuno-marquage
  • FISH
  • Utilisation de protéines de fusion fluorescentes
39
Q

Quelles sont les caractéristiques du marquage simple ou direct (microscopie à fluorescence)?

A
  • Liaison du fluorochrome à des molécules du micro-organisme

- EX: DAPI se lie spécifiquement à l’ADN (fluorescence de couleur bleue)

40
Q

Quelles sont les caractéristiques de l’immuno-marquage (microscopie à fluorescence)?

A
  • Utilisation d’un anticorps marqué par un fluorochrome
  • Direct, l’anticorps couplé à un fluorochrome est spécifique à une protéine de surface d’un micro-organisme
  • Indirect, l’utilisation d’un anticorps spécifique à un microorganisme et d’un autre spécifique au 1er anticorps et couplé à un fluorochrome
41
Q

Quelles sont les caractéristiques du marquage FISH (microscopie à fluorescence)?

A
  • Fluorescent in situ hybridization

- Sondes ADN couplées à un fluorochrome et complémentaires à un gène du micro-organsime

42
Q

Quelles sont les caractéristiques du marquage à l’utilisation de protéines de fusion fluorescentes (microscopie à fluorescence)?

A
  • Fluorochrome est généralement la Green Fluorescent Protein (GFP)
  • Le gène de la GFP et le gène d’une protéine microbienne d’intérêt sont fusionnés
43
Q

Qu’est-ce que la cytométrie en flux?

A
  • Analyse “cellule par cellule” de leur grosseur et leur taille et de la fluorescence émise par la cellule
  • Aussi utilisée pour trier des cellules analysées (ex. un tri selon l’intensité de la fluorescence)
  • Permet l’analyse qualitative et quantitative de micro-organismes
44
Q

Que permet la biologie moléculaire?

A
  • La détection et la quantification de gènes/de microorganismes
    - Détection d’agents pathogènes
    - Détection de gènes de résistance aux AB
    - Détection de gènes de virulence
  • La caractérisation de la biodiversité en micro-organismes des échantillons de bioaérosols
45
Q

Que nécessite la biologie moléculaire?

A
  • L’extraction et purification du matériel génétique
  • Amplification
  • Séquençage
46
Q

Comment se fait l’extraction/purification de l’ADN?

A
  • Lyse des cellules
  • L’extraction des protéines
  • L’élimination des autres acides nucléiques
  • La concentration de l’ADN dans un volume minimal
47
Q

Qu’est-ce que le PCR terminal?

A

Une méthode de détection et d’amplification de gènes ou de microorganismes à partir d’un échantillon (de bioaérosols, par exemple).

48
Q

Quels sont les séquences de gènes les plus souvent détectés par PCR?

A
  • L’ADNr 16S (bactéries)

- L’ADNr 18S ou l’ITS (moisissures)

49
Q

Que nécessite le PCR terminal?

A
  • Mise sur gel d’agarose pour visualiser l’amplification de la séquence ciblée
  • Le design des amorces est crucial (spécificité et sensibilité)
50
Q

Qu’est-ce que le PCR quantitatif?

A
  • Méthode de détection et quantification des gènes ou des micro-organismes d’un échantillon de bioaérosols par exemple
  • Utilisation d’un agent fluorescent et s’intercalant à l’ADN double brin seulement qui permet de quantifier le produit d’amplification
  • Vitesse d’amplification du gène ciblé est suivie en temps réel et est comparée à une courbe standard pour la quantification
  • Le cycle d’amplification à partir duquel la fluorescence est détectée indique la concentration du gène ou du microorganisme dans l’échantillon de bioaérosols
51
Q

Quelles sont les caractéristiques des analyses chimiques utilisées pour analyser des échantillons de bioaérosols?

A
  • Détection et quantification de métabolites, e composantes structurales ou de toxines.
  • Méthodes habituellement peu sensibles et nécessitent des échantillons très chargés en micro-organismes
52
Q

Donnez des exemples d’analyses chimiques.

A
  • Chromatographie en phase gazeuse
  • Chromatographie en phase liquide à haute performance
  • Spectrométrie de masse
53
Q

Quels sont les métabolites analysés chez les moisissures? les bactéries?

A
  • Ergostérols, glucanes, mycotoxines

- Acides gras hydroxylés, acides muramiques

54
Q

Qu’est-ce que la chromatographie en phase gazeuse?

A

Une méthode de détection de composés gazeux ou susceptibles d’être volatilisés par chauffage

  • Composés biologiques d’intérêts sont extraits
  • Composés sont chauffés, volatilisés et puis entrainés dans une colonne (phase stationnaire) à l’aide d’un gaz porteur
  • Selon leur affinité pour la phase stationnaire, les composés sont +/- retenus
  • Temps de rétention est toujours le même pour un composé biologique donné

L’indentification des composés biologiques présents dans l’échantillons se fait par la comparaison avec les temps de rétentions de molécules standards

55
Q

Qu’est-ce que la chromatographie en phase liquides à haute performance (HPLC)?

A

Permet la détection de composés biologiques présent dans l’échantillon en fonction de l’hydrophobicité des molécules

  • Les composées bio d’intérêt sont extraits
  • Entrainés, sous forte pression, dans une colonne (phase stationnaire) à l’aide de la phase mobile liquide
  • Selon leur affinité pour a phase stationnaire, les composés sont retenus dans la colonne

Le temps de rétention des composés biologiques dans le système permet de les détecter et de les quantifier

56
Q

Qu’est-ce que la spectrométrie de masse?

A
  • Mesure de la masse et de la composition chimique de composés biologiques d’un échantillon.
  • La SM sépare en phase gazeuse des ions en fonctions du rapport de masse/charge (m/z)
  • Obtention d’un spectre de masse représentant m/z
  • Selon la source d’ionisation utilisée, un spectre de masse peut être caractéristique d’un composé bio
  • L’indentification de la molécule est possible par comparaison avec des banques de spectres
57
Q

Qu’est-ce que le BAMS?

A
  • Utiliser pour lutter contre le bioterrorisme
  • “Bioaerosol mass spectrometry”
  • Un instrument qui peut analyser en temps réel les particules présentes dans un bioaérosol et y détecter la présence et déterminer la concentration de particules biologiques dangereuses.
  • Utilise un laser
  • Permet l’analyse du contenu chimique par SM
58
Q

Nommez les différentes méthodes d’analyse biologique.

A
  • Analyse d’une toxicité ( par exemple, les endotoxines des bactéries par l’essai LAL)
  • Analyse immunologiques (l’ELISA, détection de mycotoxines et d’antigènes)
  • Autres analyses spécifiques pour des molécules ciblées
59
Q

Qu’est-ce que l’ELISA?

A
  • Détecter et quantifier un antigène grâce à un anticorps spécifique
  • Fixation de l’antigène sur la surface d’un support solide (souvent une plaque de plastique comprenant 96 puits)
  • Ajout d’une solution contenant l’anticorps couplé à une enzyme
  • Lavage pour se débarrasser des anticorps non couplés à l’antigène
  • Ajout d’un substrat qui, modifié par l’enzyme, donne une coloration à la solution
  • Dosage (quantification) à l’aide de la courbe standard
60
Q

Qu’est-ce que l’essai LAL?

A
  • Quantification des endotoxines des bactéries à Gram négatif à partir d’un lysat d’amoebocytes de limule
  • Coagulation en présence d’endotoxines

Bioaérosols et aérobiologie (13 decks)

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