microscopie et préparation des échantillons Flashcards
Réfraction
Déviation de l’interface entre les deux milieux par rapport à sa direction d’incidence causée par un rayon lumineux qui passe entre ceux-ci
Indice de réfraction
mesure combien un milieu ralentit la vitesse de la lumière (nD air < nD verre)
déviation de la lumière
la direction et l’angle de déviation sont déterminés par les indices de réfraction des deux milieu qui forment l’interface
Les lentilles
- focalise les rayons lumineux en un pont spécifique (le foyer; F)
- distance entre le centre de la lentille et le foyer (distance focale; f)
- sa puissance dépend de la distance focale
-distance focale courte=fort grossissement
microscopes optiques (5)
- microscope à fond clair
- microscope à fond noir
- microscope à contraste de phase
- microscope à fluorescence
- microscope confocal
microscope moderne = microscope composés (image agrandie est formée de 2 lentilles ou plus)
microscope à fond clair
- basé sur la lumière
- observe les objets ou êtres vivants de 1um - 1mm
- miroirs dévient les rayons lumineux selon la trajectoire
- possède plusieurs objectifs (choisir le plus adéquat)
- produit une image foncée sur un fond brillant
microscopes compensateurs
produisent des images qui demeurent au focus quand on change d’objectifs
grossissement total
calculé en multipliant le grossissement de l’objectif par celui de l’oculaire
résolution
capacité d’une lentille à séparer/distinguer des petits objets près l’un de l’autre = rend l’image plus nette.
longueur d’onde plus courte = meilleure résolution)
ouverture angulaire
la moitié de l’angle du cône de lumière qui vient de l’échantillon et pénètre la lentille
ouverture numérique
ses ouvertures sont plus grandes, alors sa résolution est meilleure et sa distance de travail plus petite
objectif à immersion
huile à immersion ayant un nD similaire à celui du verre, alors elle augmente l’ouverture numérique et une meilleure résolution
distance de travail
la distance entre la surface antérieure de la lentille et la surface de la lame couvre objet (si utilisé) ou de l’échantillon après une mise au point fine
microscope à fond noir
- champ entourant l’échantillon apparaît noir, tandis que l’objet est brillant
- utile à observer des organismes vivants non colorés/peu contrastés
microscope à contraste de phase
- transforme les différences minimes d’indice de réfraction et de densité cellulaire en différences d’intensité lumineuse observables
- parfait moyen d’observer des cellules vivantes
microscope à fluorescence
- éclaire l’échantillon avec la lumière ultra-violette, violette ou bleue
- les échantillons sont contrastés par un colorant: fluorochrome
- permet l’obtention d’une image de l’objet résultant de la lumière fluorescente émise par le spécimen
microscope confocal
- rayon laser focalisé qui touche un point de l’échantillon
- ordinateur qui compile les images générées par chaque point, afin de reconstruire une image 3D.
buts de la préparation
- augmenter la visibilité
- accentuer les particularités morphologiques spécifiques
- préserver les échantillons en vue d’études ultérieures
la fixation
procédé ou les structures internes et externes des cellules et organismes sont conservées et fixées en place
ex: thermique et chimique
fixation à la chaleur
conserve la morphologie générale mais pas les structures intracellulaires
fixation chimique
protège les structures cellulaires fines et la morphologie de micro-organismes plus grands et délicats
la coloration
rend les structures internes et externes de la cellule plus visible en augmentant le contraste avec l’arrière plan
propriété des colorants
- possèdent des groupes chromophores (doubles liaison conjuguées - donnent la couleur au colorant)
- peuvent se lier aux cellules par interaction ionique, covalente ou hydrophobe
types de colorations
- coloration simple (1 colorant est utilisé)
ex: colorant basique et acide - coloration différentielle (distinction de m.o sur la base de leur coloration)
- ex: coloration de Gram et acido-alcoolo-résistante
colorant basique
ont des charges positives qui se fixent à des molécules chargées négativement (acides nucléiques et protéines)
ex: cristal violet, bleu de méthylène, fuchsine basique, safranine, vert de malachite.
colorant acide
ont des charges négatives qui se fixent à des molécules chargées positivement
ex: éosine, rose bengale, fuchsine acide.
Coloration de Gram
- méthode de coloration largement utilisée en bactériologie
- est divisée en deux classes: G- et G+
coloration de Gram (méthode)
- colorant primaire (cristal violet)
- mordant (iodure de potassium)
- décoloration (alcool)
- contre colorant (safranine)
coloration alcoolo-résistante
- utile à identifier des espèces alcoolorésistantes du genre MYCOBACTÉRIUM
coloration alcoolo-résistante
- chauffage avec un mélange de fuchsine basique + phénol (carbol-fuchsine)
- décoloration avec un mélange acide alcool (les cellules acido-alcoolo-résistantes restent rouge)
- contre coloration au bleu de méthylène. Les cellules qui ne sont pas acido-alcoolo-résistantes sont bleues.
coloration alcoolo-résistante (méthode)
- colorant primaire (carbol fuchsine)
- décoloration (solution d’acide-alcool)
- contre colorant (bleu de méthylène)
coloration alcoolo-résistante (explication)
- paroi est imperméable avec la chaleur et le phénol
- coloration à fuchsine basique (les cellules alcoolo-résistantes pas facilement décolorées au lavage d’acide alcool = teint rouge = grâce à plus de lipides dans la paroi des organismes)
- mycobactéries retiennent le colorant et les autres non
coloration spécifique
permet de révéler une structure particulière.
ex 1: coloration négative avec l’encre de chine/nigrosine révèle les capsules entourant les bactéries
ex 2: coloration d’endospores requiert 2 colorants (coloration de Shaeffer-Fulton) pour qu’elles apparaissent vertes/bleues dans une cellule rose/rouge.
ex 3: coloration des flagelles avec un mordant qui épaissit ces structures fines avant la coloration.
microscopie électronique
- un faisceau d’électron est utile à produire une image.
- la longueur d’onde du faisceau est plus courte que celui de la lumière = meilleure résolution.
microscopie électronique types (4)
- microscope électronique à transmission (TEM)
- préparation des échantillons/ Cryotomographie électronique
- microscope électronique à balayage
- microscope à balayage de sondes
microscope électronique à transmission (TEM)
- les électrons sont diffractés quand ils traversent l’échantillon
- ce faisceau est focalisé par des lentilles magnétiques pour former une image visible agrandie de l’échantillon sur un écran fluorescent
- les régions épaisses de l’échantillon diffracteront plus d’électrons = apparait plus sombre
microscopie électronique à transmission (TEM)
- le filament de tungstène chauffé dans le canon à électrons, génère un faisceau d’électrons et est dirigé sur l’échantillon avec le condenseur.
- la colonne contenant les lentilles + échantillon est sous-vide pour une image nette et évite une déviation des électrons qui collisionnent avec les molécules d’air
- inconvénient: échantillons doivent êtres très fins (20-100nm)
microscopie optique vs TEM
- Source de rayonnement: lumière vs canon à électron
- lentilles: en verre convexe vs magnétiques
- image finale: oeil nu vs écran
- résolution: 0,2um vs 0,5nm
- grossissement: 1000X vs 100 000X
microscopie TEM (préparation des échantillons)
- échantillon est coupé en une couche mince de 20-100nm d’épaisseur
- échantillon chimiquement fixé, déshydraté et coloré avec des produits opaques aux électrons
- autres méthodes: ombrage métallique et cryodécapage
ombrage métallique
échantillon enduit une fine couche de métaux lourds
cryodécapage
échantillon congelé est fracturé le long des lignes à grande fragilité (membranes internes)
cryotomographie électronique
- échantillons sont plongés dans un liquide très froid et observés lors leur congélation
- préservation de l’état natif des structures cellulaires
microscopie électronique à balayage
- produit une image 3D de la surface des m.o avec les électrons diffractés par la surface de l’objet plutôt qu’à partir des électrons transmis et ayant une bonne profondeur du champ
- quand le rayon d’électron touche une surface précises, les atomes à la surface émettent un petit rayon d’électrons (électrons secondaire) qui sont recueillis avec un détecteur spécial
- électrons secondaires entrent dans le détecteur, atteignent un scintillateur, émet de la lumière, transformé en un courant électrique et est amplifiée par un photomultiplicateur
- le signal envoyé par tube cathodique produit une image vue et photographiée comme une image télévisée.
microscope à balayage de sonde
- microscope à effet tunnel
- microscope à force atomique
microscope à effet tunnel
- détermine les caractères de surface par balayage de surface de l’objet avec une sonde ponctuelle
- atteint des grossissements de 100 million pour voir les atomes à la surface d’un solide.
microscope à balayage de sonde
- déplace une sonde effilée à la surface de l’échantillon tout en gardant constant la distance entre la pointe de la sonde et cette surface
- contrairement au microscope à balayage à effet tunnel, il sert à l’étude de surface qui ne conduisent pas bien l’électricité
