Metodologias de sequenciação

Question 1

Def. Eletroforese

Answer 1

Técnica de separação de fragmentos de DNA segundo o tamanho, onde fragmentos menores apresentam maior distância do ponto de aplicação que fragmentos maiores. Pode ser em gel (agarose ou poliacrilamida) ou por capilar.

Question 2

Dist. Eletroforese em gel de agarose / Eletroforese em gel de poliacrilamida

Answer 2

Agarose é utilizada para fragmentos de maior dimensão (50-20k pb). Poliacrilamida é usada para fragmentos de menor dimensão (5-500 pb).

Question 3

Def. Eletroferograma

Answer 3

Gráfico resultante de uma análise de eletroforese por capilar, onde são registados picos de fluorescência.

Question 4

Def. Enzima de Restrição

Answer 4

Enzimas que clivam o DNA em locais específicos (locais de restrição), deixando overhangs que podem posteriormente ser utilizados para outras análises.

Question 5

Def. PCR

Answer 5

Polymerase Chain Reaction. Método de amplificação de material genético que permite trabalhar com amostras menores ou degradadas.

Question 6

Dist. Primer / Template (PCR)

Answer 6

Template é o fragmento a ser amplificado (gDNA ou cDNA). Primer é uma oligosequência flanqueadora do template, necessário para o processo de amplificação.

Question 7

Fases PCR

Answer 7

Desnaturação da dupla cadeia; Ligação dos primers Fwd e Rvs (Annealing); Extensão por polimerização com nucleótidos livres.

Question 8

Def. Sequenciação de Sanger

Answer 8

Método de sequenciação de DNA baseado na incorporação seletiva de dideoxinucleótidos (ddNTP) durante o processo de replicação.

Question 9

Dist. dNTP / ddNTP

Answer 9

dNTP são nucleótidos trifosfatos incorporados na polimerização de novas cadeias nucleotídicas. ddNTP não possuem o grupo OH na extremidade 3’, impedindo a formação da ligação fosfodiéster com o nucleótido seguinte, terminando a polimerização quando incorporados numa cadeia.

Question 10

Dist. Sequenciação de Sanger Clássica / Sequenciação de Sanger Automatizada

Answer 10

Sequenciação de Sanger Clássica envolve o uso de eletroforese em gel para obter a sequência nucleotídica. A sequenciação automatizada faz uso da eletroforese capilar, obtendo a sequência por excitação de flurocromos ligados a cada ddNTP.

Question 11

Dist. Sequenciação de Sanger / NGS

Answer 11

Sequenciação de Sanger baseia-se na separação eletroforética de produtos com ddNTP incorporado para obter uma sequência individual. NGS baseia-se na sequenciação paralela, espacialmente separada, de elevadas quantidades de DNA.

Question 12

Def. qPCR

Answer 12

Variação da PCR que quantifica a amplificação do template ao longo do processo em relação a um limiar (threshold).

Question 13

Dist. RT-qPCR / RT-PCR

Answer 13

RT-PCR é uma variação da PCR capaz de amplificar cDNA por transcrição reversa de mRNA. RT-qPCR é uma variação da PCR capaz de quantificar a amplificação de cDNA durante o processo.

Question 14

Aplicações NGS

Answer 14

Obtenção de WGS (Whole Genome Sequencing) para organismos modelo e não modelo; Obtenção de SNPs ao longo do genoma com quantificação das respetivas frequências alélicas; Obtenção de genótipos individuais.

Question 15

Dist. NGS 2ªGeração / NGS 3ªGeração

Answer 15

NGS 2ªGeração amplifica templates de DNA fragmentados, produzindo reads de menor dimensão (300-500pb), com menor erro associado. A biblioteca origina-se por clonagem por pontes. NGS 3ªGeração sequencia ssDNA de maior dimensão(+10k pb), com maior erro associado. A biblioteca origina-se por formação de DNA circular.

Question 16

Passos Illumina Sequencing

Answer 16

1 - Extração de DNA
2 - Preparação da Biblioteca
2.1 - Fragmentação aleatória (Shotgun)
2.2 - Ligação de identificadores (IDs), adaptadores e primers
3 - Amplificação por pontes
4 - Sequenciação por síntese
5 - Alinhamento e análise de reads

Question 17

Passos PacBio Sequencing

Answer 17

1 - Extração de DNA
2 - Preparação da Biblioteca
2.1 - Ligação de identificadores (IDs) e adaptadores
3 - Sequenciação por leitura repetida do ssDNA circular
4 - Alinhamento e análise de reads

Question 18

Dist. RAD-Seq / Pool-Seq

Answer 18

RAD-Seq (Restriction site-associated DNA Sequencing) é útil para sequenciar organismos não modelo ou sem genoma de referência por fazer uso de enzimas de restrição para avaliar regiões de interesse. Pool-Seq serve para sequenciar uma mesma região genómica em vários organismos em simultâneo ao agrupá-los na mesma biblioteca, permitindo estimar frequências alélicas sem ser possível inferir genótipos individuais.

Question 19

Dist. PacBio / ONT MinIon

Answer 19

PacBio processa o template em micro-poços da flow cell com uma polimerase afixada a um leitor laser, ativado pela passagem do template. ONT MinIon processa o template através de microporos de uma membrana permeável, provocando alterações de corrente específicas da passagem de cada nucleótido. A passagem pelo poro é promovida pela ligação de proteínas motoras ao template.

Question 20

Def. Sequenciação de novo

Answer 20

Sequenciação de regiões genómicas de raiz.

Question 21

Dist. NGS 2ªG / NGS 3ªG (Seq. de novo)

Answer 21

NGS 2ªG mais difícil de obter genomas completos devido às reads menores. NGS 3ªG mais fácil de obter genomas completos pelas reads maiores.
Nota: A construção de um genoma de referência resulta da mistura dos dois tipos de reads.

Question 22

Ordenar produtos de sequenciação do menor para o maior.

Answer 22

Read < Contig < Scaffold

Question 23

Def. N50

Answer 23

Medida de verificação da qualidade da sequenciação. Deteta o tamanho mínimo do contig em que pelo menos 50% da base call está correta.

Question 24

Determinar N50
Contigs: 30, 100, 50, 40, 60, 70, 50

Answer 24

1º Ordenar por ordem decrescente
100, 70, 60, 50, 50, 40, 30
2º Calcular tamanho total
100+70+60+50+50+40+30 = 400
3º Dividir total ao meio
400/2 = 200
4º Achar contig que perfaz a metade
100+70 = 170+60 = 230

N50 = 60

Question 25

Dist. Depth of Coverage / Breadth of Coverage

Answer 25

Depth of Coverage diz respeito à quantidade de reads obtidas para uma dada região. Breadth of Coverage indica quanto de uma dada região está contemplada nas reads.

Question 26

Def. Genotype Call

Answer 26

Inferência de um genótipo com base na análise de reads cuja frequência ultrapassa um dado limiar.

Question 27

Rel. Genotype Call + Depth of Coverage

Answer 27

Para inferir genótipos com confiança é necessária uma depth of coverage >10x. Depths <4x não podem ser inferidos com confiança.

Question 28

Def. RNA-Seq

Answer 28

Sequenciação de cDNA através da transcrição reversa de produtos de RNA (mRNA, miRNA, tRNA, rRNA)