Metodologias de sequenciação Flashcards
Definir métodos de sequenciação e estabelecer relações entre os mesmos
Def. Eletroforese
Técnica de separação de fragmentos de DNA segundo o tamanho, onde fragmentos menores apresentam maior distância do ponto de aplicação que fragmentos maiores. Pode ser em gel (agarose ou poliacrilamida) ou por capilar.
Dist. Eletroforese em gel de agarose / Eletroforese em gel de poliacrilamida
Agarose é utilizada para fragmentos de maior dimensão (50-20k pb). Poliacrilamida é usada para fragmentos de menor dimensão (5-500 pb).
Def. Eletroferograma
Gráfico resultante de uma análise de eletroforese por capilar, onde são registados picos de fluorescência.
Def. Enzima de Restrição
Enzimas que clivam o DNA em locais específicos (locais de restrição), deixando overhangs que podem posteriormente ser utilizados para outras análises.
Def. PCR
Polymerase Chain Reaction. Método de amplificação de material genético que permite trabalhar com amostras menores ou degradadas.
Dist. Primer / Template (PCR)
Template é o fragmento a ser amplificado (gDNA ou cDNA). Primer é uma oligosequência flanqueadora do template, necessário para o processo de amplificação.
Fases PCR
Desnaturação da dupla cadeia; Ligação dos primers Fwd e Rvs (Annealing); Extensão por polimerização com nucleótidos livres.
Def. Sequenciação de Sanger
Método de sequenciação de DNA baseado na incorporação seletiva de dideoxinucleótidos (ddNTP) durante o processo de replicação.
Dist. dNTP / ddNTP
dNTP são nucleótidos trifosfatos incorporados na polimerização de novas cadeias nucleotídicas. ddNTP não possuem o grupo OH na extremidade 3’, impedindo a formação da ligação fosfodiéster com o nucleótido seguinte, terminando a polimerização quando incorporados numa cadeia.
Dist. Sequenciação de Sanger Clássica / Sequenciação de Sanger Automatizada
Sequenciação de Sanger Clássica envolve o uso de eletroforese em gel para obter a sequência nucleotídica. A sequenciação automatizada faz uso da eletroforese capilar, obtendo a sequência por excitação de flurocromos ligados a cada ddNTP.
Dist. Sequenciação de Sanger / NGS
Sequenciação de Sanger baseia-se na separação eletroforética de produtos com ddNTP incorporado para obter uma sequência individual. NGS baseia-se na sequenciação paralela, espacialmente separada, de elevadas quantidades de DNA.
Def. qPCR
Variação da PCR que quantifica a amplificação do template ao longo do processo em relação a um limiar (threshold).
Dist. RT-qPCR / RT-PCR
RT-PCR é uma variação da PCR capaz de amplificar cDNA por transcrição reversa de mRNA. RT-qPCR é uma variação da PCR capaz de quantificar a amplificação de cDNA durante o processo.
Aplicações NGS
Obtenção de WGS (Whole Genome Sequencing) para organismos modelo e não modelo; Obtenção de SNPs ao longo do genoma com quantificação das respetivas frequências alélicas; Obtenção de genótipos individuais.
Dist. NGS 2ªGeração / NGS 3ªGeração
NGS 2ªGeração amplifica templates de DNA fragmentados, produzindo reads de menor dimensão (300-500pb), com menor erro associado. A biblioteca origina-se por clonagem por pontes. NGS 3ªGeração sequencia ssDNA de maior dimensão(+10k pb), com maior erro associado. A biblioteca origina-se por formação de DNA circular.
Passos Illumina Sequencing
1 - Extração de DNA
2 - Preparação da Biblioteca
2.1 - Fragmentação aleatória (Shotgun)
2.2 - Ligação de identificadores (IDs), adaptadores e primers
3 - Amplificação por pontes
4 - Sequenciação por síntese
5 - Alinhamento e análise de reads
Passos PacBio Sequencing
1 - Extração de DNA
2 - Preparação da Biblioteca
2.1 - Ligação de identificadores (IDs) e adaptadores
3 - Sequenciação por leitura repetida do ssDNA circular
4 - Alinhamento e análise de reads
Dist. RAD-Seq / Pool-Seq
RAD-Seq (Restriction site-associated DNA Sequencing) é útil para sequenciar organismos não modelo ou sem genoma de referência por fazer uso de enzimas de restrição para avaliar regiões de interesse. Pool-Seq serve para sequenciar uma mesma região genómica em vários organismos em simultâneo ao agrupá-los na mesma biblioteca, permitindo estimar frequências alélicas sem ser possível inferir genótipos individuais.
Dist. PacBio / ONT MinIon
PacBio processa o template em micro-poços da flow cell com uma polimerase afixada a um leitor laser, ativado pela passagem do template. ONT MinIon processa o template através de microporos de uma membrana permeável, provocando alterações de corrente específicas da passagem de cada nucleótido. A passagem pelo poro é promovida pela ligação de proteínas motoras ao template.
Def. Sequenciação de novo
Sequenciação de regiões genómicas de raiz.
Dist. NGS 2ªG / NGS 3ªG (Seq. de novo)
NGS 2ªG mais difícil de obter genomas completos devido às reads menores. NGS 3ªG mais fácil de obter genomas completos pelas reads maiores.
Nota: A construção de um genoma de referência resulta da mistura dos dois tipos de reads.
Ordenar produtos de sequenciação do menor para o maior.
Read < Contig < Scaffold
Def. N50
Medida de verificação da qualidade da sequenciação. Deteta o tamanho mínimo do contig em que pelo menos 50% da base call está correta.
Determinar N50
Contigs: 30, 100, 50, 40, 60, 70, 50
1º Ordenar por ordem decrescente
100, 70, 60, 50, 50, 40, 30
2º Calcular tamanho total
100+70+60+50+50+40+30 = 400
3º Dividir total ao meio
400/2 = 200
4º Achar contig que perfaz a metade
100+70 = 170+60 = 230
N50 = 60
Dist. Depth of Coverage / Breadth of Coverage
Depth of Coverage diz respeito à quantidade de reads obtidas para uma dada região. Breadth of Coverage indica quanto de uma dada região está contemplada nas reads.
Def. Genotype Call
Inferência de um genótipo com base na análise de reads cuja frequência ultrapassa um dado limiar.
Rel. Genotype Call + Depth of Coverage
Para inferir genótipos com confiança é necessária uma depth of coverage >10x. Depths <4x não podem ser inferidos com confiança.
Def. RNA-Seq
Sequenciação de cDNA através da transcrição reversa de produtos de RNA (mRNA, miRNA, tRNA, rRNA)
