Metode rada s proteinima Flashcards
Pojmovi bitni za savladavanje metoda rada s proteinima
Metoda prema topljivosti
Usoljavanje i isoljavanje
Metoda prema naboju
Ionska zamjena
Elektroforeza
Izoelektrično fokusiranje
Metoda prema polarnosti
Adsorpcijska kromatografija
Kromatografija s obrnutim fazama
Metoda prema specifičnosti
Afinitetna kromatografija
Metoda prema veličini
Dijaliza Ultrafiltracija Gel elektroforeza Gel filtracija Ultracentrifugiranje
Kako se može odrediti struktura proteina? Koji su prednosti i nedostaci?
Difrakcija x zraka na monokristalima
Nmr
Elektronski mikroskop
Kako se može odrediti struktura proteina? Koji su prednosti i nedostaci?
Difrakcija x zraka na monokristalima
Nmr
Elektronski mikroskop
Isoljavanje objasni.
Većina proteina je slabo topljiva kod visokih koncentracija soli i to se naziva isoljavanje.
Ta se metoda onda može upotrijebiti za frakcioniranje proteina.
Ako se ukaže potreba, dijaliza se može upotrijebiti za uklanjanje soli.
Dijaliza objasni.
Način na koji se proteini mogu odijeliti od malih molekula kroz polupropusnu membranu.
Dijalizat je tekućina u kojoj se sakupljaju.
Metoda nije učinkovita za odjeljivanje proteina različitih veličina.
Objasni neke glavne principe kromatografskih metoda.
Definiraj stac i mob fazu, kako dobijemo cm?
Na stac. fazu su vezane funkcionalne skupine; ona je porozno punilo.
Mobilna faza je najčešće vod. ot. makromolekula određene ionske jakosti i pH vrijednosti.
Dio se molekula uključujući i onu koju želimo pročistiti veže na stacionarnu fazu dok većina prolazi bez vezanja.
Način na koji eluiramo ciljnu molekulu je oslabljenjem nekovalentnih interakcija sa stac. fazom ili velikom kol. molekula koje se natječu u vezanju za stacionarnu fazu.
Objasni neke glavne principe kromatografskih metoda.
Definiraj stac i mob fazu, kako dobijemo cm?
Na stac. fazu su vezane funkcionalne skupine; ona je porozno punilo.
Mobilna faza je najčešće vod. ot. makromolekula određene ionske jakosti i pH vrijednosti.
Dio se molekula uključujući i onu koju želimo pročistiti veže na stacionarnu fazu dok većina prolazi bez vezanja.
Način na koji eluiramo ciljnu molekulu je oslabljenjem nekovalentnih interakcija sa stac. fazom ili velikom kol. molekula koje se natječu u vezanju za stacionarnu fazu.
Kromatografija na ionskim izmjenjivačima objasni.
Na primjeru poz.prot., kakve kolone?
Proteini se odjeljuju na temelju nj neto naboja.
Ako proteini imaju pozitivan naboj pri pH=7, obično će se vezati za stupac kuglica koje sadržavaju karboksilatne grupe dok neće negativno nabijeni proteini.
Poz. nab. protein vezan za takav stupac može se eluirati povećanjem Konc. NaCl ili druge soli u puferu za eluiranje jer se natrijevi ioni natječu s pozitivno nabijenim skupinama proteina u vezanju za stupac.
Proteini s malom el. gustoćom prvi se pojavljuju.
POZ.NAB.PROT.-kolona karboksimetilceluloze
NEG.NAB.PROT.-kolona dietilaminoetilceluloze
Gel-filtracijska kromatografija objasni. (iliti kromatografija molekularnog isključivanja)
Temelji se na različitim veličinama molekula.
Smjesa proteina nanosi se u malome volumenu na stupac napunjen poroznim kuglicama. Budući da veliki proteini ne mogu ući u unutrašnjost kuglica, izlaze iz stupca prije malih (manji volumen im je dostupan).
Porozne kuglice načinjene su od netopljivog, ali jako hidratiziranog polimera (pr. dekstran ili agaroza).
Velike su molekule smještene u otopini između kuglica.
Molekule koje povremeno mogu ući u kuglice kreću se srednjom brzinom, a male molekule koje idu duljim i težim putem, pojaviti će se posljednje.
Afinitetna kromatografija objasni.
Što je, u koja se 3 slučaja koristi
Odjeljivanje se temelji na afinitetu između proteina i liganda. Najučinkovitija je kad je to vezanje vISOKOSPECIFIČNO.
Protein će se vezati za stupac ako je na kuglice vezan takav ligand prema kojem protein ima veliki afinitet, a drugi proteini u smjesi ne. Vezani se protein može ispustiti tako da se u stupac propusti otopina tog liganda kada zamjenjuje u veznome mjestu protein i veže se na stupac.
U 3 slučaja se koristi za izolaciju proteina koji prepoznaju molekulu X:
- X ili njezin derivat kovalentno se veže za stupac
- Dodaje se smjesa proteina na taj stupac koja se potom ispire puferom da bi se odstranili nevezani proteini.
- vezani se protein eluira velikom koncentracijom topljivog oblika X ili promjenom uvjeta koji smanjuju afinitet vezanja
Gel-elektroforeza (Objasni temelje metode, po čemu se razlikuje od gel-filtracije, u kojem se gelu izvodi, proces)
Temelji se na tome da se molekula s neto-nabojem kreće u električnom polju.
Brzina ovisi kao v=Ez/f
Molekule koje su male se lako kreću kroz gel dok molekule koje su znatno veće od pora gotovo da su nepokretne. Smjer kretanja je od vrha prema dnu. Provodi se na tankim uspravnim pločama od poliakrilamida.
Elektroforeza se razlikuje od gel-filtracije po tome što sve molekule bez obzira na veličinu su prisiljene kretati se kroz istu matricu.
Elektroforezom u poliakrilamidnom gelu pri denaturirajućim uvjerima proteini se odjeljuju ugl na osnovi mase. Smjesa proteina najprije se otapa u otopini natrijeva dodecil-sulfata SDS (anionski detergent koji razara gotovo sve nekovalentne interakcije u nativnome proteinu).
Kompleks SDS i denaturiran protein ima velik negativan naboj koji je proporcionalan masi proteina. Negativan naboj koji SDS nameće proteinu obično je mnogo veći od naboja nativnog proteina.
Elektroforeza u gelu (Kakva je to metoda, karakteristično za nju i mjerenja)
To je denaturacijska metoda.
Karakteristično je što je omjer mase i naboja konstantan (tretirani SDSom) te ti proteini imaju štapićasti oblik
Koristi se za praćenje pročišćavanja proteina.
Molekulska masa može se odrediti iz ovisnosti logmr o relativnoj migraciji
Kako znamo da je purifikacijska shema bila učinkovita?
- Mjerenje specifične aktivnosti tijekom pročišćavanja
2. Broj različitih proteina se smanjuje tijekom pročišćavanja (pratiti se može gel elektroforezom)
Izoelektrično fokusiranje objasni.
Temelji se na činjenici što kada su poteini u izoelektričnom obliku pri vrijednosti pI (pH=pI) elektroforetska pokretljivost proteina je 0 jer je z=0.
Kad se uzorak nanese narine se napon.
Provodi se elektroforeza smjese proteina u gelu s gradijentom pH (bez SDSa). Proteini se kreću dok ne postignu svoju pI.
Gradijent pH u gelu oblikuje se s pomoću elektroforeze smjese poliamfolita(malih višestruko nabijenih polimera) koji imaju različite pI.
Mogu se razdvojiti proteini s razlikom pI 0,01.
Dvodimenzionalna elektroforeza
Visoka rezolucija odjeljivanja postiže se ako se kombinira izoelektrično fokusiranje sa SDS-poliakrilamidnom elektroforezom.
UZorak se prvo podvrgne izoelektričnom fokusiranju, a potom se traka gela horizontalno položi na vrh pločastog SDS-poliakrilamidnog gela.
Proteini se šire po gelu u ovisnosti o udaljenosti do koje su dospjeli tijekom izoelektričnog fokusiranja.
Ponovnom elektroforezom u okomitome smjeru dobije se 2D odjeljivanje uzoraka u smjesi.
Na takvome su gelu proteini odjeljeni u vodoravnome smjeru na temelju izoelektrične točke, a u uspravnom smjeru na osnovi mase. (proteini iste pI vr. se potom odjeljuju na temelju mase)
Spektrometrija masa objasni.
Temelji se na razdvajanju ioniziranih molekula koje imaju razliku u omjeru mase i naboja (m/z).
Sastoji se od 3 osnovna dijela: izvor iona, analizator masa i detektor.
TOF i ESI i tandemna
Kako odrediti trodimenzionalnu strukturu proteina?
- Difrakcija rendgenskih zraka na kristalu proteina
- Nuklearna magnetska rezonancija
- Elektronska mikroskopija
Kako odrediti trodimenzionalnu strukturu proteina?
- Difrakcija rendgenskih zraka na kristalu proteina
- Nuklearna magnetska rezonancija
- Elektronska mikroskopija
