méthodes d'exploration Flashcards
définition cellule
- unité vivante
- isolée ou associée
- petite taille : visible en microscopie photonique ou électronique (10 à 20 μm)
- entité limitée par une membrane
- compartiments internes :
- SE (réticulum et noyau)
- Autres organites (mitochondries, lysosomes, peroxysomes, vésicule)
- squelette interne
- peut ou non posséder :
- éléments externes mobiles (cils et flagelles)
- excroissances plus ou moins permanentes (microvillosités..)
Fonctions cellulaires
- production d’énergie
- mouvement cellulaire et contact avec l’extérieur
- usine chimique : fabrication et destruction
- trafic intracellulaire important et avec l’extérieur
- communication : entre cellules proches (paracrines) et réponse aux stimulus du cerveau P ou C
Evénements de la vie cellulaire
- croissance
- différenciation
- reproduction
- mort cellulaire
Composition chimique
- 4 éléments qui peuvent très facilement former des chaînes (CHON) : 99% du poids cellulaire
- substance la plus abondante : eau (70%)
- différente de la compo terrestre
Composition moléculaire
chimie de base semblable pour toutes les mols
unités habituelles de microscopie
- μm = 10-6m
- nm = 10-9m
- Angström = 10-10m
Microscopie à contraste de phase
- seule qui permet d’observer des cellules vivantes
- LB = système optique particulier
- résolution en LB = 200nm
Microscopie photonique en LB
- coupes tissulaires fines (5 à 6 μm)
- cellules mortes, structures immobilisées
- analyse par histologie
- utilisation de colorants (peu spé et sensibles)
Microscopie photonique en LF
- coupes tissulaires fines (5 à 6 μm)
- cellules mortes, structures immobilisées
- analyse par histologie
- développement de marquages
- très utilisée mais plus chère
- structures très spé détectées grâce aux colorants spé
- souvent accouplé à un Ac qui reconnait une protéine spécifique
immunohistologie = histochimie
- Ac spé de la mol d’intérêt couplé à un fluorochrome
- détecte spécifiquement un type de protéines dans une cellule => étude de la localisation, quantification..
- limites : 2 ou 3 max
- protéines au même endroit = co-existance
Vidéo microscopie
- images en 3D
- plusieurs photos à différents étages
- suit les mouvements intracellulaires
- fluorescence
- temps plus longs
Microscope confocal à balayage laser
- laser + système électronique + composants optiques
- gagne en netteté par rapport au microscope classique
- images en 3D
- double ou triple marquage
Microscopies électroniques
- sujets très petits
- microscopie basée sur le faisceau d’électrons
- images en 3D
- coupes très fines
Tomographie à électrons
- microscope électronique + système numérique
- images en 3D
- échantillons congelés
- pas de limites en marquages
- gagne en netteté par rapport au microscope à transmission
Isolement à partir d’un tissu
- digestion protéique : dissocie cellule de la matrice et entre elles
- séparation des pops entre elles : centrifugation, attachement au plastique, tri par cytométrie en flux
- mise en culture
Tri cellulaire par cytométrie en flux
- quantification de sous-populations d’une même population selon PLUSIEURS paramètres : nombre, volume..
- tri de sous-populations selon ces paramètres (haute pureté)
Séparations des organites
- centrifugation à très haute vitesse (ultracentrifugation)
- sépare les différentes structures en fonction de leur DENSITÉ (après digestion ou cassure de la membrane)
Techniques d’analyse de l’ADN, des ARN et des protéines (étapes)
1) électrophorèse + coloration
2) transfert sur un filtre par capillarité
3) hybridation avec marqueur spécifique
4) révélation de l’Ac couplé à la protéine ou sonde fixée sur l’ADN/ARN
Hybridation in situ, FISH
- détection d’ADN/ARN à l’aide de sondes complémentaires sur tissus, cellules entières ou chromosomes étalés
- très utilisé en génétique médicale
Protéines fluorescentes
- GFP
- construction d’un gène codant pour la protéine d’intérêt + GFP (gène chimère)
- introduction dans la cellule
- visualisation (quantification, localisation)
- méthode INDIRECTE
FRAP
- étude du temps de diffusion d’une protéine
- utilisation de la GFP
- laser qui “nettoie” la fluorescence
Électrophysiologie cellulaire
- mesure de l’activité des canaux ioniques membranaires par patch-clamp
- étude des flux ioniques intracellulaires par sondes fluorescentes
- mesure du pH intracellulaire
limites de la microscopie optique
- résolution limitée (>200,nm)
- invention : microscopie en super-résolution =
nanoscopie :
-> réduit la tâche de diffraction
-> mise en évidence des mols fluorescentes uniques - amélioration de facteur 10 de la résolution
