Méthodes Flashcards
RT-PCR
Retrotranscription d’un ARN messager pour passer d’un ARN à un ADN complémentaire qui pourra être amplifié par des oligonucléotides spécifiques pour le quantifier
Cytométrie en flux
Technique permettant de faire défiler des particules, molécules ou cellules à grande vitesse dans le faisceau d’un laser, en les comptant et en les caractérisant. La lumière réémise (par diffusion ou fluorescence) permet de classer la population des molécules/cellules suivant plusieurs critères et de les trier.
Paramètre SSC en cytométrie
Side Scatter: la lumière diffractée mesurée sur le côté avec le détecteur plus ou moins perpendiculaire au rayon laser donne une mesure de la granularité (complexité) de la cellule : plus il y a de la lumière diffractée vers le côté par rapport au laser, plus la granularité de la cellule est importante.
Paramètre FSC en cytométrie
Forward Scatter : la lumière diffractée mesurée sur par un détecteur en face du laser dans le cône de lumière diffractée permet d’évaluer la taille des cellules : plus la cellule est grande, plus grand et le cône de diffraction.
Cytofluorométrie en flux
On utilise des anticorps dirigés contre les marqueurs qui sont couplés à des fluorochromes qu’on peut exciter avec un laser présent dans le cytomètre et donc détecter de manière spécifique les cellules dans lesquelles ce marquer est présent.
FACS
Fluorescence-activated cell sorting : tri des cellules par taille en fonction de leur fluorescence opéré par ordinateur
Principe de marquage CFSE
La fluorescence est diluée quand les cellules se divisent (la méthode sert à étudier la prolifération des cellules).
Principe de test Elispot
Détecter et dénombrer les cellules activées en détectant la sécrétion d’une molécule (ex. détecter les cellules B actives en détectant la sécrétion d’immunoglobulines).
Les cellules sont placées dans le puit. On utilise un anticorps de capture qui fixe les molécules sécrétées (ex: immunoglobulines), ensuite on utilise un auter anticorps (anticorps de détection) qui va se fixer sur un autre épitope de la molécule sécrétée. Ce anticorps de détection sera couplé à la biotine qui a capacité de fixer à streptavidine conjugué à un enzyme premettant d’obtenir une réaction enzymatique sous forme des spots colorés ce qui permets de détecter la présence des molécules sécrétées.
Témoin de charge en Western Blot
Les témoins de charge indiquent que les protéines ont été adéquatement transférées sur la membrane au cours du test Western blot. Les anticorps dirigés contre les témoins de charge sont des témoins importants car ils indiquent si les échantillons ont été chargés de manière égale dans les différents puits.
Les témoins de charge sont typiquement des protéines omniprésentes exprimées à des niveaux élevés. Le niveau d’expression des témoins de charge doit rester le même quel que soit le type de tissu ou de cellule et quelles que soient les conditions expérimentales.
