méthode d'étude en histologie Flashcards
Qu’est-ce que la cytologie ?
Étude analytique des cellules
Qu’est-ce ce que l’histologie ?
Étude analytique des tissus
qu’est ce qu’un épitélium ?
Ensemble de cellules jointives, sans interposition de substances intercellulaires reposant sur une lame ou membrane basale
Quels sont les deux types d’épithélium ?
glandulaire (sécrétion)
malpighien (revêtement)
qu’est ce qu’un tissu conjonctif ?
Ensemble de cellules séparées par une substance intercellulaire, ne reposant pas sur une lame basale
qu’est ce qu’un tissu musculaire ?
Tissu conjonctif spécialisé dans la conversion d’une énergie chimique en un travail mécanique unidirectionnel
Quelles sont les types de tissus conjonctifs ?
Tissus conjonctifs commun
Tissus osseux, cartilagineux, adipeux
sang, moelle osseuse
tissus lymphoïdes
Quelles sont les types de tissus musculaires ?
squelettique
lisse
cardiaque
Qu’est-ce qu’un tissu nerveux ?
Ensemble de cellules jointives, ne reposant pas sur une lame basale, spécialisées dans la création et la transmission d’une information
Quels sont les types de tissus nerveux ?
Périphérique
Central
végétatif
Qu’est ce qu’un microscope optique ?
instrument de base de la cytologie et l’histologie. Il permet l’observation d’un échantillon transparent, contrasté, interposé dans l’axe d’un trajet opaque dans le spectre de la lumière visible.
Le microscope optique obéit aux lois géométriques et non pas ondulatoires.
De bas en haut, quels sont les constituants du microscope optique ?
source, condenseur, échantillon/ préparation, objectif, oculaire, observateur
où se trouve les diaphragme ? a quoi ils servent ?
Il peut y avoir des diaphragmes intercalés entre la source et le condensateur ou entre le condensateur et la préparation pour gérer la quantité de lumière.
À quoi sert le condenseur ?
Content condenseur ne change pas le grossissement, il améliore la luminosité en la répartissant au mieux
À quoi sert l’objectif ?
L’objectif grossir plusieurs fois, agit sur la qualité de l’image et améliore la puissance du microscope. Un bon objectif c’est un bon microscope. Grossissement de 2,5 À 125 fois, l’objectif est fixe
À quoi sert l’oculaire ?
L’oculaire grossi plusieurs fois mais n’apporte aucun changement sur la qualité de l’image.
Quelles sont les trois lentilles ?
Le condenseur, l’objectif et l’oculaire
Que peut-on trouver en plus sur un microscope moderne ?
ajout de prismes pour regarder assis, debout …
Par quel principe est déterminé la résolution ?
Selon les principes de l’optique ondulatoire et non de l’ optique géométrique
Qu’est-ce que la tâche d’AIRY ?
Dans le plan image, chaque point lumineux du plan objet ce projette sous forme d’une figure de diffraction. Il y a formation d’une figure de diffraction d’un point : la tâche d’AIRY.
Qu’est-ce que la résolution ?
La résolution est la distance minimale entre deux points séparables
Quelle est la formule de la résolution ?
d = 0,61x lambda/ NA Avec lambda : longueur d'onde d : la résolution NA ouverture numérique (NA=n'.sinnu' n' : indice du milieu image nu' : demi d'entrée de l'objectif)
Qu’est-ce que le pouvoir séparateur ?
C’est l’inverse de la limite de résolution : 1/d
Que faire pour minimiser d ou augmenter le pouvoir séparateur ?
Lambda faible : bleu/ UV
Indice de milieu > 1 (objectif à immersion, air remplacé par de l’huile)
Angle d’ouverture nu’ plus grand (sinus’ proche de 1)
De combien est la limite de résolution en lumière visible ?
Entre 200 et 600nm (soit 400nm)
Combien mesure une cellule en moyenne ? Est-il possible de voir les organiques ?
Une cellule de mesure en moyenne 10 à 20 microns ; en MO on ne peut donc pas atteindre la résolution subcellulaire (ordre de 10, 20, 30 nm)
Quels sont les techniques dérivées ?
L’accentuation des contrastes
L’épifluorescence
Microscopie confocale
Qu’utilise-t-on pour accentuer les contrastes ?
- Lumière polarisée avec deux polariseurs
- le contraste de phase
- le champ noir
- le contraste interférentiel
Qu’est-ce que la lumière polarisée ?
On utilise un verre spécial microgravé qui ne laisse passer les photons choisis. On cherche à identifier des structures cristallines qui dévient la lumière.
On utilise des filtre de polarisation ; un avant la préparation et un après
On trouve principalement des fibres végétales
Qu’est-ce que le contraste de phase ?
La source est au dessus de l’examinateur, on va venir dégager les contours des cellules et noyaux. Observer sans tuer (pas de colorant)
Qu’est-ce que le champ noir ?
Il est utilisé pour des organismes entiers. On illumine sur le côté de l’objet
Qu’est-ce que le contraste interférentiel ?
On a accès à des détails (10nm) —> utilisation ingénierie… S’intéresse aux surfaces. Principe : dissocier le signal recueilli en fonction de la longueur d’onde des photons transmise au travers de la préparation. Utilisation de miroir motorisé.
observation de tissu osseux, finement organisé donc on peut le voir mais uniquement en surface, résolution fine et image en noir et blanc.
Sur quoi se base l’épifluorescence ?
Effet photoélectrique
Décalage de Stockes
Qu’est-ce que l’Effet photoélectrique ?
transition d’un électron si excitation par un photon d’énergie suffisante (spectre d’absorption ou spectre d’excitation)
Qu’est-ce que le décalage de Stockes ?
retour de l’électron, avec émission d’un photon dans une gamme de longueur d’onde d’énergie inférieure à celle du photon excitateur (spectre d’émission).
Comment fonctionne l’épifluorescence ?
Une une source émet une lumière qui se dirige sur un miroir. Le miroir laisse passer certains photos et en réfléchi d’autres
Qu’est-ce que les fluorochromes ?
Ce sont des substances fluorescentes exogènes possible la cellule qui nous intéresse.
Exemples de fluorochromes
FITC, rhodamine, cyanine, fluoréscéine, ALEXA fluors
Qu’est-ce que la microscopie confocale ?
C’est la microscopie qu’on utilise en épi fluorescence : on illuminé par le haut un filtre passe bas puis un miroir dichroïque.
Les composants de l’échantillon absorbent cette longueur d’onde et en émettent une nouvelle : les rayons passent et atteignent le récepteur. Entre l’échantillon est le miroir dichroïque, l’objectif je joue également le rôle de condenseur.
On utilise de préférence des rayons UV mais on peut également utiliser des colorants fluorescents en plus.
Résumer en cinq point la microscopie confocale
- source UV laser
- mouvement synchrone de l’objectif et du condenseur
- focalisation du système d’illumination et de recueil
- résolution supérieure
- projection pour reconstructions 3D
Quelles sont les étapes de préparation des tissus ?
La fixation, l’inclusion, la coupe, la coloration
Qu’est-ce que la fixation ?
Immersion d’un tissu dans une solution liquide destinée à maintenir l’état du tissu et des cellules dans un état morphologique proche du vivant
Comment se déroule la fixation ?
Fixation par formation de ponts entre protéines : ponts méthylènes.
Le but étant d’empêcher la putréfaction et que le tissu ne bouge
Quels sont les substances utilisées pour former les ponts ?
- aldéhydes : FORMALDÉHYDE = FORMOL : Liaison avec CH2O et NH2 libres des protéines.
glutaraldéhyde - métaux lourds
Quelles sont les substances utilisées pour faire précipiter les protéines ?
- alcools : éthanol, butane, isopropanol
- acides : acétique, picrique
Quelles sont les facteurs intervenant sur la fixation ?
- teneur en lipide/ protides/ eau / calcium
- épaisseur des tissus
- accessibilité au fixateur / rapidité (sacrifice par perfusion)
- température de fixation (froid meilleur)
Qu’utilise-t-on pour décalcifier les tissus ?
- acide acétique, nitrique
- EDTA, EGTA
Quelles sont les étapes de l’enrobage ?
- fixation / inclusion des tissus
- deshydratation par bains concentration croissante d’éthanol
- imbibition de l’échantillon dans un milieu intermédiaire, xylène
- imbibition paraffine liquide = imprégnation
- formation de bloc d’inclusion
Quel est le principe de l’enrobage ?
Inclusion de l’échantillon dans un milieu un peu plus dur homogène permettant la réalisation de coupes d’épaisseur constante
Quelles sont les quatre types de coupe ?
- microtomie ( 2 à 15 microns)
- cryo-microtomie
- ultra microtomie (50 à 70nm)
- ultra- cryothérapie- microtomie
Comment se déroule la coupe ?
Le bloc de tissu est placé sur un bras oscillant, qui oscille de haut en bas et avance d’une mesure déterminée (svt 2-5 microns). On tient un ruban
Comment se déroule l’étalement ?
On récupère le ruban que l’on place sur une lame de verre sur laquelle on a placé une goutte d’eau. On pose la lame de verre sur un support chauffant, l’eau chauffe, la paraffine se déplisse, on a plus de stries !
NB: coupe sériée = on utilise tout le ruban
quels sont les deux problèmes que pose le FFPE.
FFPE pose quelques pb : on ne peut plus mettre en évidence les graisses puisqu’elle ont été dissoutes/ et le formol forme des ponts méthylène, on a un «magma», un assemblage -> pas cool on doit procéder à un démarquage de ce qui a été masqué par le formol.
-» on utilise alors du tissu congelé !
Quelle est l’alternative à la FFPE: expliquer
On utilise des CRYOPROTECTEURs pour empêcher la congélation.
Tissu préalablement fixé ou non. On immerge le tissu dans un bain. Mais il va s’entourer de bulles d’azote gazeux et le tissu sera isolé et donc ne congèlera pas. C’est pourquoi on utilise de l’isopentane, N2 et congélateur.
On souhaite des tissus sans cristaux, il faut donc respecter la chaînent du froid :
CRYOMICROTOME : microtome placé dans une enceinte froide. = microtone + enceinte froide
= cryostat
Qu’est ce que la coloration ?
mise en évidence pour l’analyse. Renforcer les contrastes entre les différentes structures du tissu (noyau, protéines dans cytoplasme, membrane).
comment se déroule la coloration ?
- retirer la paraffine, on met du colorant sur un tissu sans paraffine = réhydratation ou déparaffinage
On va venir remettre de l’eau dans le tissu. On immerge le coupes dans du xylène puis bain d’éthanol de concentration décroissante (100-95-90-50%). Pour finir, bain d’eau distillée : le tissu est prêt à être coloré.
Quels sont les types de colorants ?
végétal
teintures
Laque
Méthodes photographique (sel d’argent)
quels sont les colorants trichrome ?
- HEMATOXYLINE : colore les acides nucléiques (colorant basique, couleur violacé)
- ERYTHROSINE, ÉOSINE : colore les protéines/ (cytoplasmes). (rouge brillant)
- SAFRAN/ VERT LUMIÈRE : colore le collagène, substances intercellulaires
(May Grumwald grimes : réactifs de cytologie)
Quelle sont les quatre techniques de mise en évidence d’un constituant spécifique ?
- immunohistochimie
- histochimie
- immunoenzymologie
- hybridation in situ
Qu’est ce qui permet d’avoir une meilleure résolution en ME ?
les électrons accélérés dans le vide permettent d’avoir une longueur d’onde très petite (énergie grande) (il faut toujours regarder la formule de la résolution : on voit bien qu’on ne peut agir réellement que sur lambda)
De bas en haut : décrire un MET
- source : filament chauffé ou diode à vide
- anode
-» anode + filament = CANON A ELECTRONS - lentille électromagnétique
- préparation transparente aux électrons
- lentille électromagnétique
- caméra/ écran (peint de terre rare)
VIDE
comparer résolution MET et ME à balayage
Résolution en MET meilleure que résolution ME à balayage
jusqu’à combien peut aller la différence de potentiel sur un MET
100 000 Volt
à quoi sert la lentilles électromagnétiques sur MET ?
de condenseur entre canon et préparation
d’objectif entre préparation et caméra
caractéristiques de la ME à balayage
- surfaces réfléchissantes
- carbone à la surface des cellules
- illumine par le COTE
- sert à voir des petits objets en relief
Avantages du ME
- balayage point par point
- simple mais nécessite ingénieurs, prix et refroidir pièce
Résolution MET
1nm (permet donc de voir des organites)
particularité des coupes pour ME
- coupes ultrafines
- 50 à 100 nm d’épaisseur
- inclus en résine époxy
- couteau de diamant
- échantillon de petite taille et autolyse minime
- fixateur : glutaraldéhyde
- technique d’imprégnation : éthanol (déshydrateur), oxyde de propylène, résine liquide et quelques catalyseurs
comment se déroule l’enrobage pour une coupe ultrafine ?
- d’abord coupe SEMI-FINE : repérer ce qui nous intéresse :
dégrossir, trouver zone d’intérêt au MO avec coupe de 500 nm à 1 micron - retirer ce qui n’a pas d’intérêt (crayon)
coupe ultrafine : ULTRAMICROTOME : 50nm d’épaisseur
comment observe-t-on une coupe ultra fine ?
- suport métallique, grille “barreaux métalliques”
- renforcer le constate avec des SELS D’OSMONIUM juste APRES FIXATION et AVANT ENROBAGE
Quelle technique de mise en évidence est possible en ME ?
- immunohistochimie : Ac (pas de fluorochrome mais ENZYME) marqués avec bille de métal argent ou or et billes toujours le même diamètre : 5-10nm
