Les techniques de mise en évidence d'un constituant spécifique Flashcards
Qu’est ce que l’histochimie ?
ensemble des coloration signalétique mettant en évidence un composé spécifique : lipides : huile rouge, noir, Soudan III
Retenir que pour mettre en évidence Glucides ou graisses il faut un colorant adéquat
Glucides, sucres: PAS = acide périodique associé au colorant shiff
Fer, cuivre = sels de métaux : PERLS, Turnbult
Sels d’argent : calcium, levures, prolongement nerveux, dégénérescence
Quel est le principe de l’immunohistochimie ?
- application d’un anticorps spécifique d’une substance (immunosérum) sur une préparation histologique ou embryologique.
- anticorps directement couplé à un système de marquage : immunohistochimie directe
- L’anticorps est détecté par un second anticorps spécifique de l’espèce : immunohistochimie indirecte
Quels sont les deux types d’anticorps ?
- Anticorps poly-clonaux : obtenus par purification des anticorps présent dans le sérum d’un animal immunisé contre la substance recherchée
- Anticorps monoclonaux : obtenus par la méthode des hybrides (fusion de cellules cancéreuses et de cellules plasmocytaires immortalisées, recueillies chez un animal immunisé)
Quels sont les deux aspects important en immunohistochimie ?
- la sensibilité (bien car détecte petite quantité mais bruit de fond)
- la spécificité (extrêmement spécifique de ce que l’on a)
Qu’ajoute-t-on pour rendre visible les complexes Ag-Ac ? (= quels sont les marqueurs ?)
fluorochrome
isotopes radioactif
enzyme
Comment procède-t-on pour obtenir des Ac polyclonaux ? Inconvénient ?
On injecte à un animal un antigène, il se produit une première réaction immunitaire puis après un rappel, nouvelle injection : il y a un réaction immunitaire secondaire. Cela se traduit pas la sélection des cellules de l’immunité ( plasmocytes très efficace pour lutter contre Ag)
On recueil alors des clones = une population cellulaire. Certain vont être plus spécifique ou plus sensible que d’autre. On va extraire un immun sérum : immun sérum polyclonal contenant des Ac polyclonaux. Il est très sensible mais pas très spécifique ce qui laisse l’effet de bruit de fond.
De plus on est dépendant de l’animal (pb s’il meurt)
-> expose au risque de perdre facilement la source de notre outil…
On utilise alors des animaux «résistants» comme chèvre, ane, porc, cheval, mouton, lapin…
Comment procède-t-on pour obtenir des Ac monoclonaux ? Pourquoi est-ce intéressant ?
On prend une souris, à qui on injecte l’Ag, on attend que les réactions primaire et secondaire se fassent : la souris va sélectionner un ensemble de clones plasmocytaires qui synthétisent autant d’Ac différents. On va alors tuer l’animal et récupérer les cellules immunitaires au niveau de la rate. On va immortaliser les cellules de l’immunité en hybridant avec des cellules cancéreuses : HYBRIDOME.
En quelques semaine on obtient un registre d’Ac variés et les Ac sont toujours produits dans le milieux de culture = Ac monoclonaux.
On a une quantité d’Ac phénoménale et sur le long terme (de plus on peu congeler les cultures et s’en resservir plus tard).
On arrive à sélectionner des Ac très spécifique -» interessant
Sérums monoclonaux : utilisation de petits animaux, comme les rongeurs (rats, souris, hamster…)
Comment se déroule l’immunoistochimie directe ?
Sur la lame, le tissu qui contient la séquence peptique. On place dessus un sérum contenant des anticorps. La partie variable de l’Ac se fixe sur l’épitope = partie spécifique de l’Ag. On marque la partie constante de l’anticorps = marqueur
-> simple, rapide mais, peu rentable …
Comment se déroule l’immunoistochimie indirecte ?
Sur l’Ac monoclonal de souris = Ac primaire (très spécifique), on va utiliser un anticorps secondaire qui va se fixer sur l’Ac de souris. On part alors d’Ac anti-souris qui peut venir par exemple d’une chèvre. Ces anticorps sont peu couteux, faciles, disponibles et surtout très sensible ! On va alors AMPLIFIER la réaction car de nombreux fluorochromes/ isotopes… vont pouvoir se fixer sur l’Ac anti-animal de l’Ac primaire.
Comment se déroule l’immunohistochimie indirecte à TECHNIQUES MULTIPLES ?
IMMUNOFLUORESCENCE, >on cherche à mettre en évidence la localisation des protéines (Ag).
On peut utiliser des enzyme au lieu de fluorochrome : peroxydase de Raifort, phosphatase alcaline
>L’avantage c’est que l’on peut observer à la lumière blanche et que ça dure dans le temps contrairement aux fluorochromes (évanescence)
Quels sont les 6 termes à retenir de l’IHC ?
- Ac primaire = celui qu’on met sur la coupe
- Ac secondaire = celui qui est dirigé spécifiquement contre une espèce spécifique de l’Ac primaire
- IHC directe = juste Ac primaire
- IHC indirecte = un primaire et secondaire
- Monoclonal ce sont des techniques qui vont immortaliser un clone de cellule immunitaire
- Polyclonal = saignée d’un animal purifié pour récupérer l’intégralité des immunoglobulines à l’issu d’une «vaccination»
Sur quoi se base l’immunoenzymologie ?
> Mettre en évidence l’activité enzymatique et voir si les enzymes sont efficaces.
On utilise uniquement des tissus congelés et il faut les garder congelés (meilleure conditions possibles) On incube coupe de tissu
On ajoute du SUBSTRAT et du COSUBSTRAT sur la coupe ainsi que des COENZYMES : un PRODUIT se forme mais il est soluble dans l’eau, incolore et se détruit vite.
On produit donc une seconde réaction pour rendre l’activité enzymatique visible et durable.
On peut modifier le pH, la température, intervention de co-substrat (sensibles au concentrations en sels).
Attention : on détecte l’activité enzymatique associé à la présence d’enzymes et non pas la simple présence des enzymes (sinon autre méthode)
Qu’est ce qu’une enzyme ?
protéine qui catalyse une réaction réversible
SUBSTRAT ———-> PRODUIT : L’enzyme accentue un sens de la réaction et permet d’obtenir le produit et rendre le substrat absent
A quoi sert l’histologie moléculaire in situ ?
Mettre en évidence in situ une séquence nucléotidique particulière (ARNm ADN). Mettre en évidence de l’ADN normal, et chercher des mutations, des réarrangements de gènes, ou bien un ARN signalétique. On utilise cette technique pour détecter la présence de cancer, virus …
Comment procède-t-on pour chercher une séquence d’ADN (histologie moléculaire in situ) ?
ADN double- brin : à l’intérieur d’une coupe de tissu. Cet ADN porte une séquence que l’on veut mettre en évidence. On commence par DENATURER l’ADN : on chauffe la lame et on la met en présence d’enzymes, de sels minéraux, pour séparer les 2 brins.
On synthétise une SONDE : séquence que l’on connaît à l’intérieur du gène.
On dépose une sonde : séquence d’acides nucléiques complémentaires de ce qu’on veut détecter. En laissant reposer, on provoque la renaturation en partie de l’ADN, qui va s’HYBRIDER avec la sonde.
Puis on utilise Fluorochrome, isotopes … ou DIGOXIGENINE pour rendre visible le tout :
HYBRIDATION IN SITU
FISH (détecter l’hybridation par fluorescence)
