mboc - week 3 Flashcards
Waarom DNA en RNA 5 naar 3 gevormd
energiesource is daar want zit al fosfaat op nucleotide. Bij verkeerde kan het ook makkelijk vervangen worden. 3 naar 5 zou reactie stoppen want de trifosfaat zou dan weg zijn
charged amino acids
dragons eat knights riding horses
d - aspartic acid
e - glutamic acid
k - lysine
r - arginine
h - histidine
KHR - positive
DE negative
nonpolar amino acids
vaak in membraan
grandma always visits london in may for westministers palace and cathedral
g - glycine
a - alanine
v - valine
l - leucine
i - isoleucine
m - methionine
f - fenylalanine
w - tryptofaan
p - proline
c - cysteine
essentiele arminozuren
valine, methionine, tryptophan, leucine, phenylalanine, threonine
proline waarom afwijkend
heeft als enige geen vrije aminogroep, maakt secondary structures move, zit aan randen
vorming eiwitten volgorde terminals
van n naar c terminal
vouwen eiwitten soort bonds – hydrofobe interacties, ionische interacties, waterstofbruggen
disulfide bond functie
zorgt dat eiwitten kunnen stretchen en weer relaxen. Enige covalente bond. Breekbaar met reducing environment (reductants, electrons opnemers). Redox
wat bepaalt interacties tussen eiwitten
secundaire vouwing.
hoeveel proteincoderende genen, SNPs en splice variants
20.000 proteincoderende genen maar 75.000 SNPs, 200.000 splice variants, 10 million combinational variants
Enzym werking
veranderen niet energieverbruik, maar versnellen wel. Voorbeeld; hydrogenbond rearrangements , soms cofactor nodig (vit a for rhodopsin, heme voor hemoglobine)
deltaG
usable energy, waar we iets mee kunnen. G reaction = G product – G substrate
Enzymreactie michaelis menten
Snelheid = max snelheid x substrate/(substraat +km)
E + S <->(k-1 en k1) ES <-> (k2) P
Km = k2+k1)/K1, waarbij Km affinity constant is. Lezen als afbraak ES/ opbouw ES geeft affiniteitsconstante
Lower Km -> quicker Vm (te zien aan ronde vorm grafiek begin heel snel)
V = (vmax x S) / (Km +S)
relatie tussen Ki en I
Ki (binding affinity for inhibitor) is neg gecorreleerd met i (inhibiting factor van medicijn), lagere Ki geeft hogere I en dan hogere Km
Ion exchange chromatography
negatief eiwit dan positieve ionen op column
Gel filtration chromatography
grote eiwitten zijn sneller drijvend door column dan klein
Affinity chromatography
iets met hoge affiniteit zoals Ab. Kan je ook inbrengen in vector (epitope tagged protein)
Protein identification
Waar actifity of interest is bepalen, allene focussen op dat deel van grafiek. Pool fractions and apply to next column
SDS
- Saturating proteins with SDS gives equal charge to all proteins, beta mercaptoethanol serves to break down disulfide bridges
- Onderkant dus positief van gel, want eiwitten bovenin geladen en zijn negatief
- Maar een band op SDS en actifity of interest in grafiek dan succes
2d gel
- niet denatureren, noncharged proteins
- te ordenen op charge en size
- stipjes kunnen geanalyseerd met MS
MS
- Trypsine knipt tussen arginine en lysine (R/K)
- Mass to charge ratio
Afwijkende plaats maken eiwitten
Mitochondrium worden ook eiwitten gemaakt die daar thuishoren
Eigenschappen tussen membraan
hydrofoob
Eigenschappen Buitenlaag phospholipidenmembraan
hydrofiel
Eigenschappen binnenkant membraan
negatief geladen
Dikte membraan
5nm
Hydropathy index
meerdere keren onder en boven as dan gaat het meerdere keren door membraan (spanning membrane)
Kenmerken integraal proteins
lysine, isoleucine vaak abundant
vaak helical I, L, F
hydrofoob
Ankeren van eiwitten waarmee
door fatty acid (-oyl/yl) of prenyl
Energetically favorable shape membrane
bilayer spheres
Effect van saturatie vetten op membraan –
membraan wordt dunner met unsaturated (want tails zijn niet recht door cis (niet trans!) double bonds
Measuring membrane fluidity
laurdan – diep in membraan gevestigd. Fluid phase/gel phase geven andere emission wavelength, kunnen zo met elkaar vergeleken worden onder microscoop
Phospholipid charateristics
head group (choline, phophate, glycerol) may give charge, fatty acid determines membrane fluidity
Phosphatidylethanolamine hoofdgroep
neutraal
Phosphatidylserine hoofdgroep
negatief en fosfaat negatief, amine pos – overall negative
Phosphatidylcholine hoofdgroep
neutraal
sphingomyelin hoofdgroep
neutraal
sphingosine hoofdgroep
positief
Lateral diffusion
gebeurt vaak kost geen energie
Flip flop
gebeurt bijna nooit, kost enerige
Lipid rafts/raft domain
verstijven van membraan door cholesterol in upper layer, ook meer fatty acids. Interacteren met elkaar
FRAP
Recovery of fluorescence; how much movement takes place. Nooit terug naar origineel level want je hebt gebleekt
Address label on proteins
signal sequenc aan amino (N) einde, of signal patch door sequences in midden
Signaal voor protein naar kern
5 positief geladen amino acids KenR
eentje naar neutraal dan werkt het neit meer
Export kern signaal
niet specifiek besproken, nakijken
Import in mitochondria signaal
alfa helix like, hydrofoob
Import naar plastids signaal
niet geladen, hydrofiel
Peroxisoom signaal
SKL C einde, blijft op mature eiwit
translocatie van gevouwen eiwitten
Import naar ER singaal
N terminal sequence; hydrofoob gevolgd door polar
Return naar ER signaal
lys-asp-glu-leu KDEL – herkent signal sequence en trekt terug
Prokaryote signal sequences
tijdens translatie trnaslocatie. SRP stopt ribosoom, gaat pas weer verder bij binden membraan. Proteins voor post-translocatie = sec, tat, com
SecA
protein voor post-translocatie van proteins naar ER in prokaryoten, kost ATP. (in baccilus subtidis)
lepB knipt en protein gaat zo naar periplasm
TAT
twin arginine translocase verplaatst gevouwde eiwitten over inner membrane naar periplasm, niet met ATP maar met proton motive force
welke protein secretion van gram negatieve bacterien spant over inner, outer en host membrane?
type 3, 4 en 6
Type 1 protein secretion
gebruikt ATP binding casette (ABC) om energie te gebruiken voor export en gebruikt een beta channel
Nucleus in eukaryotes as protein target waardoorheen vervoerd
proteins do not pass membrane but water channel (nuclear pore)
Nuclear protein import receptor werking
heeft lading tegenovergesteld aan signaal
cargo bindt receptor en veranderen conformatie, kunnen daardoor fibril binden van pore. Ran-GTP zorgt dat het weer loslaat van fibril aan binnenkant pore
Proof of N-terminal positively charged amphipathic signal sequences on proteins
door protease toe te voegen wordt alelen wat aan buitenkant cel zit afgebroken, bij detergent + protease alles
Translocatie naar mitochondia vanuit cytosol;
positief geladen n terminal signaal bindt tom op buiter membraan – verplaastsing, protein gaat naar tim op inner membrane. Signaal er af geknipt. Energie nodig voor tom complex, komt van hsp70 chaperones met ATP. Energie voor tim complex komt van positieve n terminal eiwit, wordt gebonden door hsp70, ATP erbij.
Gekoppeld aan membraanpotentiaal
Proteins to inner membrane space mitochondria pathway
OXA kan op inner membrane weer eiwit naar buiten brengen wanneer protein een tweede signal sequence heeft die zichtbaar wordt na knippen eerste signaal. Kan ook door lezen tweede sequence door TIM complex, blijft hangen in inner membrane
Tim 22
internal signal sequence, via TOM naar tussenruimte membranen, vanaf daar door TIM22 in inner membrane gezet
zonder eerst naar matrix te gaan, direct vanaf cytosol via lumen
Protein to intermembrane mitochondria pathway (tussen membranen)
door cleaving na uitbrengen door OXA of TIM
Waar halen mitochondria energie vandaan
voltage and pH
Meten van activiteit van mitochondria
- Hangt af van pH
- FRAP
- GFP – kleur hangt af van pH
Pex5 + docking
geeft wss transient pore, nog niet goed genoeg onderzocht
ER heeft peroxisome gevormd. pH daarbinnen is onbekend, miss hoog
Peroxisome oorsprong
komt uit ER
Co translational ER protein import studie
isoleren ruw en glad ER, scheiden door centrifugeren
Ribosomes worden hoe op ER gezet
SRP cycle helpt het op membraan zetten; recognition, targeting, release, recycling. Low km for SRP.
Hoe te zien dat ribosoom translocator protein hermetisch is afgesloten
met fluorescence quenching with I
Wat gebeurt bij translocatie eiwit naar ER met signaal sequences
signal sequence blijft achter in membraan. Indien het membrane protein is komt internal stop transfer sequence in ER membraan vast te zitten. Normaal COOH naar cytosol, kan ook andersom als signal sequence andersom zit. Signal sequence gaat altijd in membraan met – kant eerst. Double bond kan ook, beide terminals naar cytosol.
Solluble protein hoe op juiste plek gebracht vanuit ER
N glycosilation op asparagine. alleen wanneer het gevolgd wordt door ander aminozuur (behalve proline) en daarna serine of threonine. In membraan zit anker met glucose die kan binden. Flippase brengt protein naar buiten door hydrofiele tunnel.
O glycosilation op OH van serine/threonine
glycosilatie ER waarom en stappen
controle eiwitvouwing
dolichol wordt gefosforyleerd en daarna suiker geplakt mbv CTP, UDP,GTP
geflipt naar ER kantvoor verdere uitbreiding
Als proteinfolding niet goed gaat in ER
meer chaperones. Eiwit met ribonuclease domain aan cytosol kant – maak tnieuw RNA, daardoor meer chaperones.
Niet meer te herstellen eiwit ER stappen
suiker en ubiquitine er op gezet wanneer het net aangekomen is in cytosol – proteasoom
COP2
Golgi
(forward signal)
COP1
Golgi
(backward signal)
clathrin
signaal vanaf extracellular space andere kant om dingen naar binnen te brengen
Clathrin vessicle formation
carbo bindt receptor, adaptor protein bindt daar boenop, bud formation. Clatherin vormt rondom de vessicle. Daarna wordt vessicle uncoated. Cargo receptor proteins worden herkend door adaptor proteins met hogeaffiniteit
Gtp hydrolisis in dynamin role
BAR domain adaptor dimerisation causes GTP hydrolysis in dynamin and drives conformational change, brings membranes in close proximity for fusion (clatherin vessicle en membraan)
Binden van vessicle
rab GTP en v snare binden, rab effector bindt rab GTP. V snare op vessicle herkent t snare, verstrengelen., membraan versmelt. rabGDP laat los, neemt lipid group mee, geeft het weer aan GEF waardoor GDP weer GTP kan worden
Targeting soluble proteins for ER
Moet in transport vessicle gaan zitten, dit gebeurt met KDEL sequence (soluble ER resident protein). Gaat op receptor zitten, vormt COPI coat.
Glycosilatie N kant
begint altijd met core (GlcNAc and man. Complex oligosacharrides bevatten ook nog galactose en NANA. NIET PRECIEZE STRUCTUREN LEREN.
Endo-H
knipt high mannose sugars. Sensitiviteit laat ER en golgi traficing volgen. Dik bandje (smear) kan wijzen op glycosilation, vaststellen door behandelen met Endo-H wat veel dunner moet worden. Na 60 min niet meer gegelycosileerd, al verder in ER, te zien aan feit dat alleen endo F nog knipt (knipt alle n linked sugars)
Lysosome
enzymen voor break down of cells. Breken extracellulair materiaal af (bacterien) and damaged organelles
ook voor recyclen receptor zoals glut4
LSD
lysosomal storage disease – bouwen zich op. Niet meer met leven verenigbaar.
Treatment LSD – infusie van enzym geven
Hoe komen stoffen in de lysosoom
mannose 6 phosphate kan op oplosbare enzymen worden geplakt. Lysosoom enzyme met internal signal patch bindt GlcNAc phosphotransferase, maakt van mannose groep op enzym mannose 6 fosfaat. Waarschijnlijk afgebroken door gebrek aan lading icm hoge pH. Vormt vessicle en komt aan bij lysome, receptor gerecycled. Membrane bound enzymes gebruiken ander systeem.
MAPK
werkt als molecular switch. Aan of uit door fosforylatie (mbv kinase) of defosforylatie (mbv phosphatase). Bij kinase kost het ATP
Mitogen (iets wat het iets doet met de cel) bindt receptor, activeert Ras, activeert MAPK, driestapsfosforylatie, activatie transcription factors. Myc protein geactiveerd, stimuleert genen die zorgen voor celgroei door G1-Cdk (cytoplasma groei). G1/S Cdk daardoor geactiveerd. Rb actief, activeert E2F. gesimplificeerd; input – gentranscriptie – myc – overgang G1 naar S. hoe snel en hoe veel geproduceerd is belangrijk.
- Mitogen activeert
- Ras GTP activeert
- MAPKKK – Raf +ATP activeert
- Mek+ATP activeert
- Erk+ATP activeert
- Gene expression or protein production door fosforylatie, daarom ATP nodig in vorige stap
- Serine, threonine, tyrosine kunnen gefosforyleerd worden
FORMULES PROMOTOR ZELF NALEZEN
JO
Half life transcription factor
1/K is exact de Km.
De-sensitization receptor signal
- Geactiveerde GPCR (receptor) activeert GRK om de GPCR te fosforyleren
- Arrestin kan de gefosforyleerde receptor binden
RTK activatie
- Signal protein bindt
- Trans autophosphorylation activeert kinase domain
- Trnas autophosphorylation maakt bindingsplaatsen voro signaalmoleculen
- Signaal moleculen brengen signal downstream
- Hebben allemaal een tyrosine kinase domain, eigenlijk altijd dimeer
RTK for Platelet Derived Growth Factor (PDEF)
driestaps fosforylatie
RTK pathway
- Geactiveerde RTK kan adaptor protein Grb2 aciveren
- Dit activeert Ras-GEF (SOS)
- Ras activation using GTP
Ras protein functie
relay signals from RTK
Signalling complexes snelheid
kunnen snel en langzaam aan en uit worden gezet
* Hyperbolic – intenser in the beginning, flattens
* Sigmoidal – accumulate more activating input before effect occurs
* All or none
Key phases met checkpoints celdeling:
- Chromosoom replicatie en celgroei
- Chromosoom segregatie
- Celdeling
Cdc checkpoint proteins onderzoek
Onderzoek gedaan door hoge restrictive temperatures (stopt bv g1 naar S overgang)
Cdk proteins
allemaal gebonden aan cylcin, opbouw en afbraak geeft aan welke fase van de cel
* G1/S Cdk – wordt snel afgebroken bij begin S fase
* S-Cdk
* M-Cdk
Activatie cdk
cdk bindt cyclin door T loop (gedeeltelijk actief), mbv ATP gefosforyleert (geheel actief). Dus meer signalen nodig om compleet te activeren. Echter, als je nog een P toevoegt door Wee1 kinase is het weer inactief, als Cdc25 deze weer verwijderd is het weer actief.
ubiquitine kan een cdk verwijderen en zo plaats maken vor andere cdk
Cdk inhibitors
gecontroleerd door afbraak in proteasoom. Actief SCF complex en f box protein binden Cdk I met fosforylatie. Ub gestapeld en afgebroken
Cdc6
wordt gecontroleerd door S-Cdk. Fosforylatie Cdc6 leidt tot degradatie en DNA recplicatie compleet. Gebeurt maar een keer per cell cycle want DNA moet maar een keer gerepliceerd. Is key to prevent progression wanener DNA replicatie is niet normaal. Toevoeging hydroxyurea stopt S fase, caffeine er nog bij zorgt voor suicidal mitosis.
Check DNA integriteit niet goed door bv DNA schade, wat dan
- Kinase stabiliseert P53 door fosforylatie
- Stabiel P53 bindt p21 gene promotor, wordt gemaakt
- 21 protein bindt G1/S cdk-cyclin complex en inactiveert
Ontstaan cervix kanker
- Rb bindt proliferatie factor, p 53 bindt verder downstream, zorgen voor remming proliferatie
- Viral proteins binden Rb en p53, proliferatie gaat door
Rol van Rb (retinoblastoma) protein in expressie s phase
rb inactief door e7 of fosfor door cdk4/6cyclin D.
wanneer inactief dan kan rb geen complex met e2f vormen
E2F is vrij en promoot expressie van s phase genes
cdk4/6cyclin D kan geremd worden door CKI p16
wanneer cdk14 wordt geremd door p16 is Rb inactief, kan E2F binden en zo samen promotor, leidt tot remmen S phase
wanneer p16 inactief is kunnen cdk14 en cyclin een complex vormen. dit activeert Rb, kan binden aan de promotor en de S cycle beginnen. verder creeert E2F een positieve feedback loop
Myc en rb
mediaten receptor stimulere activatie voor celdeling
* Myc bindt cyclin D, SCF, E2F, zorgen allemaal voor voortgang naar S phase
overexpression myc - p53 mediated cell cylce arrest/apoptosis - p19 active - inactive mdm2 - p53 active
Overproduction myc voorkomen
- P19ARF stabiliseert p53
- P53 mediated cell arrest/apoptose
Apoptose
extrinsic - death receptor and ligand (fas) - caspase 8 - caspase 3
intrinsic - mitochondria damaged - cytochrome c - apaf 1 - caspase 9 - caspase 3
Neural plasticity ontstaan
door apoptose, match number of cells to target
uncharged amino acids
santa tests new quilts yearly
s - serine
t - threonine
n - asparagine
q - glutamine
y - tyrosine
essential amino acids
K - lycine
H - histidine
T - threonine
V - valine
I - isoleucine
L - leucine
P - proline
M - methionine
W - tryptofaan
Kim houdt van terassen in warme lente maanden p
which amino acid can be glycosylated
N - asparagine
which amino acid can be phosphorylated
S - serine
T - threonine
Y - tyrosine
what modifications can be made to K?
ubiquitinated
acetylated
methylated
which amino acid can form disulfide bridges?
C - cysteine
which amino acid is a helix breaker (often found in domain edges)
P - proline
how can protein folding be reversed
with urea
alfa helices
in het geval van pores:
hydrofobic aan kant van interior
hydrofiel aan kant solvent
beta sheets
kunnen paralel of antiparallel zijn
hoe worden SS bruggen gemaakt
H+ wordt van SH gehaald
kan intra of interchain
hoe wordt geubiquitineerd
misfolded degradation signal op eiwit target protein naar E2/E3
1 Ub op eiwit geplakt
E1 plaatst herhaaldelijk Ub mbv ATP
effect antibiotics op protein synthesis in bacterien waardoor
binden EPA sites op ribosoom
cathalytic triad
D - aspartic acid
H - histidine
S - serine
D haalt een proton van S
S maakt covalente binding met enzymsubstraat, hydrolyse van peptide bond
hydrogen bond rearrangement
vmax
kcat . Etot
v
vmax . S/(Km+S)
waarom is een double reciprocal plot handig om te kijken naar inhibitors
omdat de Km stijgt zonder dat de Vmax stijgt
slope gaat alleen vermeerderen en grafiek gaat meer naar rechts
wat gebruiken als er geen antilichaam is tegne het eiwit
een epitoop
echter kan dit de vouwing beinvloeden
logische volgorde om protein of interest te purificeren
eerst purificatie
mogelijk filteren op charge en size
daarna met antilichaam of direct MS na stap 1
hydropathy plots
laat zien wat hydrofoob is en wat niet, handig voor transmembrane proteins
bepalen welke kant n terminus en c terminus zullen zijn
helically shaped hydrophobic domains amino acids
I - isoleucine
L - leucine
F - phenylalanine
A - alanine
how to measure lateral membrane protein diffusion rates
using fluorescently tagged marker proteins
translocatie naar matrix vanuit mitochondria
cytoxolic hsp70 houdt eiwit ongevouwen,
TIM doorheen
gedreven door membrane potential
oxidative phosphorylation
complex 1 accepteert elektronen uit tca en via NADH gaat het naar
ubiquinone
complex 3 brengt h+ naar intermembrane space
cytochrome c
complex 5 gebruikt elektronen en H+ om O naar water te maken, H+ is translocated naar itermembrane space
proton gradient, H+ kan alleen terug naar matrix via atp syntase
sommige complexen gemaakt door mitochondrial DNA, msis te hydrofoob voor cytosol
andere door DNA die moeten naar inner mitochondriaal membraan
pHluorin GFP
used to measure the pH within certain organelles in vivo by making a fusion protein with the right signal sequence
peroxisomen waar gemaakt en functie
in ER, nieuw door fission or de novo
beta oxidatie van long chain fatty acids. gebruiken H2O2. catalase voorkomt stapeling
import naar ER stappen
signal peptide wordt herkend door SRP
translatie stopt
ribosoom-SRP-protein complex wordt herkend door SRP R op ruw ER
dit interacts with translocator
translatie herstart
fluorescence quencing with I-
I- cannot access the fluorescent dye in the membrane bound ribosomes, but it can reach it in free ribosomes
shows that the translocaotr channel in the ER is hermetically sealed
translocatie naar ER transmembraan in eukaryoten
ATP verbruikt en Hsp70 die eiwit naar lumen trekken
spliced start transfer en internal stop transfer
N terminus in ER, C terminus in cytosol, of beiden in cytosol
stopsignaal kan er af worden geknipt, in midden blijven hangen, of twee kunnen een double loop vormen
foute vouwing eiwit herkenning ER
Suiker aan redoxomgeving blootgesteld, krijgt hoge affiniteit voor calnexin die helpt met vouwen en bindt glucosidase indien vouwing correct is, die splitst glucose. Als er nog meer hydrofiele plekken zijn en vouwing onjuist dan bindt glucosyl transferase en begint het opnieuw.
wat gebeurt als veel eiwitten tegelijk verkeerd gevouwen zijn
ER signaal dat er meer chaperones moeten komen dmv binden trnasmembrane kinase
stimuleert endoribonuclease activity
splicen premRNA naar mRNA
verschil in ER glycosilation en Golgi modification
ER glycosylation bevat alleen simpele oligosacchariden, en gevoelig voor EndoH
golgi zijn meer complexe oligos, alleen gevoelig voor EndoF
gauchers disease
glucocerebrosidase deficient (voor glucosylceramide)
enzym geven kan oplossen (enzyme replacement therapy)
g protein coupled receptors pathway
g protein geactiveerd
laat gdp vrij en bindt gtp
alfa dissociates van beta-gamma
phospholipase c geactiveerd
knipt pip2 in ip3 en dag
ip3 opent ca in er
dag en ca activeren protein kinase c
welke aminozuren kunnen gefosforyleerd worden
serine
threonine
tyrosine
in prokaryoten ook histidine
desensitization van gpcr
gpcr activeert ook grk
grk gefosforyleerd
arrestin bindt gpcr
functie van scaffold
niet amplificeren
water oplosbaar dus kunnen wel meerdere proteins downstream activeren
fases celcyclus
g1 - groeien cel na deling
s - DNA replicatie
G2 - groei en kijken of DNA replicatie heeft plaatsgevonden
M - celdeling
wat is nodig om overte gaan naar een andere fase van de celdeling
afbreken van cyclin van een fase (zoals m cyclin APC/C in metaphase) mbv ubiquitine zodat andere kan opkomen
p27
bindt cyclin cdk en inactifeert
effect hydroxyurea en caffeine op cell cycle
hydroxyurea in combinatie met cdc6 dependent signalling zorgt er voor dat in de s fase wordt gestopt
caffeine induceert suicidal mitosis
p53
actief na fosforylatie
na ubiquitine door mdm2 afgebroken
activeert p21activeert g1/s cdk en s cdk
papilloma virus werking
produceren e6 en e7 die twee tumorsupressors remmen - p53 en rb
