mboc - week 1 Flashcards
semi conservatief
een nieuwe en een oude strand, zoals DNA synthese, met oud als template
DNA synthese stappen
splicen en vormen
DNA synthese Splicing stappen
helicase verbruikt ATP. Supercoilen en topoisomerase maakt een knik in DNA om stress te verlagen. DNA beschermd door DNA binding protein.
DNA synthese vorming stappen
5’naar 3’ gevormd, vormt door dubbelstrengs DNA als primer om te starten. 3’ OH einde is waar polymerase aan bindt. leading strand 3’ to 5’, dus directe transcriptie. Lagging strand kan loopt van 5’ naar 3’, polymerase vormt daarom ozaki fragmenten, gaps opgevold door RNA primer, daarna lygase plakt.
Proofreading DNA polymerase verlaging van aantal fouten
van 1 per 10^5 nucleotiden zonder proofreading naar 1 per 10^7 met proofreading. Met strand directed mismatch repair 1 per 1^10
DNA repair na transcpriptie voltooid is waardoor
door MutS/MutL, vindt met scannen nick in DNA strand, verwijdert gesynthetiseerde helft zodat deze opnieuw gemaakt kan worden
Chemische verandering in DNA bases zij heel veel voorkomend, 2 soorten:
depurinatie en deaminatie
depurination
depurination door ROS hele basis verwijderd – hele AT (of GC) verwijderd, of weer ingebouwd
deamination
deamination haalt een NH2 er af, verandert cytosine naar uracil - C veranderd naar A, of hersteld
sangers dideoxy sequencing
nu niet meer gebruikt, nog wel weten. gebruik chain terminators (hebben 3’H ipv 3’OH einde, geen verlenging strand mogelijk). Met veel dNTP en weinig ddATP. 4 keer herhalen voor elke nucleotide. CCAT primer bepaalt begin van reactie. Radioactief gelabeld en met elecrophoresis gescheiden geeft volgorde.
lastiger voor grote fragmenten
Manuele sequencing methoden –
radioactief, fluorescent 4 lanes, fluorescent 1 lane, capillary (1-96 wells)
Genome sequencing
door middel van artificial chromosomes, die in stukjes clonen en dan proberen te binden aan genoom omdat het uiteindelijk wel plakt.
Parallel sequencing
in een picoliter op mocroscopic beads - verschillende soorten, ook next generation sequencing genoemd
Pyrosequencing
DNA sequence is fixed op een grid. incorporation van dNTP die een PPi afstaat wat omgezet kan worden in ATP mbv suylfurylase. Dit is verbruikt door luciferase, straalt zo licht uit. geeft een pyrogram – hogere amplitude laat zien waar base zit die je wilt meten (een per keer). apyrase vernielt unincorporated dNTPs
Ion torrent sequencing
nucleotide bindt waarbij PP vrijkomt en een H+, dit geeft een pH verandering die gemeten kan worden. Te veel nucleotiden dan verschil pH niet meer te meten is limitatie
minION
soort usb, in laptop te pluggen
PCR
verhitten tot 95 denatureert, fragmentlengte bepaald door zelfgemaakte primers die hechten bij 50-55 graden, vervolgens DNA vermeerderd door toevoegen dATP, dGTP, dCTP, dTTP bij 72 graden. Pas na 3 cycles heb je goede lengte, de originele template zal ook altijd blijven bestaan. Sensitive en fast, maar fragment length is kort en homologous DNA sequences bestaan.
RT PCR
reverse transcriptase erbij en dNTP erbij, ds mRNA-DNA gemaakt, tweede primer maakt ds cDNA er van. Ook kennis vereist over homoloog DNA en aminovolgorde. Is ook sensitive en fast, maar 5’end race for ful length en gene families
VNTR
variable number tandem repeat) is een reeks van 10 tot 100 opeenvolgende genetische herhalingen van een genetische sequentie zoals CAG
SNP
single-nucleotide polymorphism
substitution of a single nucleotide at a specific position in the genome that is present in a sufficiently large fraction of considered population
Hoeveel procent van menselijk DNA codeert voor eiwitten:
2 %
Doel databanken:
*vergelijken onbekend
*Identificatie
*Chromosome structure / synteny
*Intron / exon boundaries
*Phylogeny
DNA regio’s van 5’naar 3’
Begint aan 5’ metupstream regulatory region, promotor (CAAT en TATA (enige promotor element voor TATA binding protein)). Untranslated region na transcription start ligt nog oor de initiator codon (AUG), stopt bij terminator codon (UGA, UAA, UAG), daarna nog signaal voor 3’end trimming en polyA
Intron opbouw -
meestal beginnend met GU en eindigend met AG, is een essentiele A in het middel
hoeveel procent van genen hebben alternatieve splicing
35%
Homolog
descent from same ancestor DNA, separated by speciation (see ortholog) or genetic duplication (see paralog).
Ortholog
in different species from a common ancestral gene by speciation, still same function. givesreliable prediction of gene function in newly sequenced genomes.
Paralog
related by duplication within a genome. New function
Orthologs vs paralogs
Orthologs retain the same function in the course of evolution, whereas
paralogs evolve new functions, even if these are related to the original one
Synteny
the preserved order of genes between related organisms.
*rearrange is geen probleem, geen effect
* generally preserved between tightly related species.
Conservation of the order of a cluster of genes suggests a
functional relation.
BLASTP
basic local alignment of sequences tool; finding similar proteins using databank analysis. Handig voor alignment trees
Ka
non-synonymous substitution ratio (base change leads to different amino acid)
Ks
synonymous substitution ratio (base change leads to same amino acid)
Ka/Ks<1 meaning
no selection
Ka/Ks>1 meaning
strong selection
Microarray expression
aankleuren genen die tot expressie zijn mbv fluorophores (rood en groen) voor 2 specifieke condities en gewassen over microarray
mRNA bindt DNA, wassen, scannen
Mrcroarray vs RNA seq –
microarrays alleen te zien bij veel meer expressie en voorafkennis nodig van alternative splicing. Sommige dingen niet mogelijk met microarray bv; onderscheid mature RNA vna unspliced, strandedness, single cell analysis. Bij RNA seq fuzzy, wel minder error, geen cross hybridization.
Proteomics vroeger
gesorteerd op grootte en zuurgraad.
MS-
knippen na bepaald aminozuur, peptidemix geladen door ionen, delen van proteine gesorteerd naar mass to charge ratio, gebaseerd op time of flight
MS/MS –
zelfde als ms maar na mass filter is alleen precursor ion selection gemaakt. Dit gaat door inert gas, door tweede analyzer en komt op de detector. Ook mass to charge ratio gesorteerd, gebaseerd op time of flight
METABOLOMICS??
??
Differential gene expression
change in read counts or expression levels
door fosforylatie
mRNA
code protein
rRNA
ribosomaal voor catalyseren proteine synthese
tRNA
transfer, adaptor tussen mRNA en aminozuur
telomerase RNA
template voor telomerase aan einde chromosoom
snRNA
in combinatie met protein voor splicing
snoRNA
nucleolar – to modify rRNA
hoeveel producten kunnen gemaakt worden van een RNA strand
RNA polymerase dupliceert maar een van twee strands, daarom kunnen twee verschhillende producten afgeschreve worden van een streng RNA
Soorten RNA polymerase
- 1 – maakt rRNA
- 2 – protein coding genes
- 3 - maakt tRNA en snRNA NALEZEN
Verschil prokaryoot en eukaryoot mRNA –
- prokaryoot codeert voor meerdere proteins (polycistronic)
- Eukaryoot worden introns uitgehaald, RNA krijgt 5’GPPP cap en poly A tail
Splicing mechanisme –
herkenning splice site aan intron, folding secundaire structuur door fosfodiester binding (in exon?) waarbij OH gevormd wordt aan 5. Een 5’- 2’ ontstaat in intron, en een reactieve OH blijft over aan 5’ einde, reageren, exonen komen samen. snRNA betrokken omdat ze binden aan pre mRNA waardoor evenwicht verstoord is. NALEZEN
RNA information flow
in prokaryoten in een compartiment, in eukaryoten in meerdere compartimenten zoals nucleus en cytosol
Capping waarbij en waarom
- In eukaryoot mRNA
- 5’cap van 7 methyl guanosine triphosphate
- Voorkomt dat RNA degradation
- Nodig voor transport uit nucleus en guidance naar ribosoom
stappen capping
RNA triphosphatase
guanylyltransferase
methyltransferase
Polyadenylation waar en waarom
- Alleen bij eukaryoot mRNA
- Voor nuclear export nodig
- Voorkomt afbraak
Polyadenylation stappen
- RNA polymerase, vaak AAUAAA, herkent
- Knipt RNA
- Poly A polymerase plakt de poly A staart. Geen template nodig!
Differential gene expression meten –
RNA blot maken door RNA extract, denatureren op elektroforese, blotten
Quantative RT-PCR of single gene
Less cycles gives more RNA, more cycles gives less RNA DIT NALEZEN
prokaryoot transcriptiefactoren
prokaryoten hebben een sigma factor (activator protein) die moet binden om te starten, bindt direct aan promotor.
Eukaryoten transcriptionfactoren
tata box binding protein binds first en hieraan (initiator complex) bindt RNA polymerase, hieromheen zit een mediator. Een activator protein op enhancer kan hieraan binden.
Gel shift essay
labelen DNA van interesse, gebonden zal trager door gel gaan
DNA binding proteins aantonen
EERSTE MANIER TERUGLEZEN
Gel shift essay
Veranderen coderend deel door iets anders om te kijken welke functie het had
Reporter genes
lacZ – blauw
uidA – blauw
gfp – groen
luc – licht
chromatin looping
reguleert genexpressie vanaf afstand
shg en limb gene zijn bijvoorbeeld verbonden, mutatie in een geeft probleem in ander gebied
op hoeveel plaatsen kunnen histonstaarten worden gemodificeerd
18 verschillende plekken. Phosphorylation, acetylation en methylation, ook meerderen op een aminozuur.
microRNA
complementeren mRNA en kunnen hiermee transcriptie blokkeren
siRNA -
Bescherming tegen transprosons (dsRNA), zelfde als microRNA
welk aminozuur kan maar door een code gemaakt worden
M
Translatie begin en einde -
40s rRNA en initiation complex start, eindig bij 60s. NALEZEN
tRNA
draagt aminozuren; peptikeketen gevormd op ribosoom. RNA sequence matcht tRNA anticodon
normaal 1 tRNA per codon, maar eigenlijk 4 herkend met 2 tRNAs omdat GU paar samen wordt herkend (GU wobble) OPZOEKEN WAT I WOBBLE IS
stopcodon – binden van release factor, verplaatsen NALEZEN MET PLAATJE
prokaryoot vs eukaryoot ribosoombinding
prokaryoot - ribosome binding site AUG bindt initiator tRNAwaar het kan dienen als startpunt voor binding ribosoom
eukaryoot – eerste AUG gezocht door complex, en tRNA dient als 5’ cap.
hoe werkt exit side ribosoom
- peptidyl aan c terminus vervangen door aminoacyl tRNA waarna reactie eindigt
genetische variatie virus
Virus – willen genoom zo klein mogelijk houden, gebruiken daarom frameshift. Kan door secundaire structuur RNA en veel UUUUU aan begin, ander reading frame.
Proofreading translation –
incorrect tRNA kan verwijderd, verbruikt GTP. Niet zelfde als bij polymerase, want daarbij is band al gemaakt, hierbij niet.
Prokaryoot maakt 1 fout per 10^4 aminozuren.
minder fouten in DNA replicatie, dit en transcriptie hebben echter ergere gevolgen
f box protein
herkent afbreeksignaal op protein en zend naar UBI ligase complex.
Effect hoeveelheid ubiquitine op uitkomst
Monoubiquitine – histonregulatie
Multi ubiquitine – endocytose
Poly – proteasoom of DNA repair
SUMO en RUB hebben zelfde functie (ubiquitin like)
ubiquitine ligase complex kan uit en aan worden gezet
verschil introns en exons in vliegen/wormen en mensen
in vlieg/worm is exonlengte vrijwel niet veranderbaar, daardoor aannemelijk dat het behouden wordt en splicing niet gedaan
three prevailing hypotheses to account for the evolution of ‘humanness traits’:
- protein evolution
- the ‘less-is-more’ hypothesis
- changes in the regions of the genome that regulate gene activity
Restriction enzyme Type 1
more subunits, specific recognition, maar knipt <1000 bp downstream
restriction enzyme Type 2
een enzym herkent en knipt sequence, ander enzym methyleert. Herkent palindromen (zoals TA – AT naast elkaar). Voorbeeld EcoRI
restriction enzyme Type 3
een enzym knipt en methyleert 24-26 bp daar vanaf
Werking restriction enzymes
als dimeren en herkennen DNA sequence. RG/GNCCY. R purines (AG), Y pirimidines (CT) CHECKEN. Visualiseren door gelelectroferese.
Isochizomeren
enzymen die zelfde sequence herkennen.
DNA ligase werking
herstelt phosphodiesterbond door hydrolyse van ATP
4 manieren van DNA eindes plakken
- Blunt end plakken met ligase en ATP
- 1x 5’ overhang kan je gewoon nucleotiden toevoegen
- 2x 5’overhang kan je plakken met ligase en ATP
- 3’ prime overhang kan niet worden aangevuld met nucleotiden, moet dus met nuclease geknipt en dan geplakt.
Cloning vector stappen –
knippen met restrictie nuclease, DNA ligase en DNA fragment toevoegen. AB resistence toevoegen om te checken of het goed is ingebouw.
waaraan moet cloning vector voldoen
regio die integratie faciliteert (biral backbone
* Origin of replication
* High copy number (>10 copies per cell)
* Selection marker (antibiotic resistance gene) want gen er in houden kost veel energie
* Unique restriction/recombination sites to insert DNA
* Simple method to establish recombinants
(blue / white screening)
promotor en terminator voor goed inzetten
Waarop letten bij kiezen recognition sites plasmide voor restrictie enzymen
- Unique sites – je wilt niet plasmide in 5 stukjes knippen
- Reading frame intact laten
- Checken op gel of je 2 bandjes ziet bij recombinant
Genomic library
millions of genomic DNA fragments in bacterial vector geplakt. Mocht je hele menselijk genoom willen dan heb je 3 x 10^5 clones nodig
cDNA library kan ook gemaakt, maar niet omvang te berekenen omdat het gaat om al het RNA wat op dat moment gemaakt werd
PCR cloning genomic fragments voor en nadelen
als je weet welk stuk en niet te groot, dan geen library nodig. Is snel en sensitief, maar alleen voor kleine stukjes en geeft homoloog DNA.
cDNA synthese stappen
polyA tail mRNA gebruikt voor polyT primer. Reverse transcriptase toegevoegd en deoxy, alkali lost RNA op. tweede DNA strand gemaakt door polymerase. Geeft double strand cDNA. Is sensitief en snel, maar 5’ end RACE for full length, en gene families
PCR fragment hoe in vector geplaatst
direct geplakt in vector met topoisomerase
Gibson assembly van PCR fragment in vector
Plasmid knippen met restrictienuclease, dan exonuclease (5’ er af voor overhanging ends die overeen moeten komen met plasmide), zelfde bij cDNA doen. Dan DNA polymerase en ligase toevoegen
DNA in vector
library, foreign gene in transgenic organism plaatsen, knock out, mutated form of gene, analyze activity of promoter by fusion to reporter gene
Introduction of non permeable substances (DNA, RNA) in animal cells opties
- Microinjection
- Electroporation
- Liposomes
- Particle bombardment (met gouddeeltjes beschieten), niet meer gebruikt
Transfectan
metaboliet, facilitates uptake op DNA
DNA transfer to animal cell cultrures
- Direct – microinjection, particle bombardment
- Transfection – chemical, liposomes, electroporation
- Transduction – viral
- Transient expression up to 6 days, temporary episomal expression of DNA
Integreren DNA in host probleem –
integreert niet waar je wilt, is compleet random
Transgenic animal
- Injection in pronucleus of zygote – niet effectief
- Removing nucleus and bringing back another (with altered gene construction)
- Kern plaatsen in eicel
Changing gene activity in transgenic animals
- Homologous strand, plek kiezen, gene of interest should fit. Neomycin (G418) en gancyclovir resistance toevoegen om te kijken of het goed is geintegreerd
- Zinc finger nucleases
- TALEN
- CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9
cas9 creeert dubbele break
transgene ingebouwd
Gene silencing vs gene editing
Gene silencing – disruption, gene editing – template met nieuwe sequence. Gebeurt beide met guide RNA
lncRNA
lang, niet coderend
geen functie of scaffold om bv x chromosoom te inactiveren
miRNA
micro
blokkeren tranlatie mRNA en zorgen zo voor degradatie
siRNA
interfering
genexpressie uit door mRNA afbraak
piRNA
binden piwi eiwitten en beschermen germline tegen transposable elements
wanneer heeft DNA polymerase moeite
repetitief of CG rijke gebieden
hierarchical shotgun sequencing
vorm van whole genome sequencing;
DNA geamplificeerd en in BAC gezet
gesequenced
overlapping stukjes geplakt
voor klein genoom zonder repetitie
bij mensen restriction enzyme sites in clone vergelijken met whole genome
contig
verzamelen van meerdere stukjes DNA tot een geheel
verschillen pyrosequencing en dideoxy
pyro geeft smaller reads
pyro is met microscopie en camera, dideoxy is met gel/capillair electrophorese/laser based
pyro blijven geincorporeerd worden
pyro is in spheres ipv gels/tubes/capillaries
illumina sequencing
dNTPs gelabeld met fluorescentie, 4 kleuren dus allemaal tegelijk
ION TORRENT sequencing
bij vrijkomen van PPi komt ook een H vrij, verandering in pH
minION/nanopore
DNA getrokken door nanopore door immobilized/fixed motor proteins
quick and dirty
bioNano
alleen bepaalde delen van DNA gelabeld zoals repetitief of restriction sites
quick and dirty
AFLP PCR
een of meerdere restrictieenzymen toegevoegd
adaptor geplakt
seletief sommige fragmenten vermeerderd
op gel gezet
handig om aan of afwezigheid van genen te vergelijken tussen soorten
gen
alles betrokken bij expressie van exons
synteny
behoud van volgorde van een cluster genen - wijst op functionele relatiep
operon
cluster van genen gecontroleerd door een enkele promotor
dotplot analyse
van homologous proteins
elk puntje staat voor een stuk van x aminozuren voor tenminste y gelijke aminozuren
RNA seq
high throughput cDNA sequencing
2d gelanalyse proteomics
scheidt op twee waarden zoals lading (pKa=pH), grootte, gewicht op SDS gel
pdb
database for protein structures
kegg
for modeling metabolic pathways
verschil transcriptie prokaryoten en eukaryoten
prokaryoten - een mRNA codeert voor meerdere proteins, andere manier van transcriptie nodig. direct binden RNAP2 aan promoter, regulatoir bindt op of dichtbij
bij eukaryoten introns er uit, hebben 5 en 3 einde. RNAP2 bindt tata, regulatoir bindt ver weg
northern blot
totaal RNA isoleren
rRNA verwijderen dmv gel
blot met DNA fragment probes
QPCR
fluorescent aan RNA, kan in real time gemeten
boven treshold zegt iets over initial amount of transcript
less cycles = more RNA
cis element
regulatoir element op zelfde chromosoom
trans acting factor
werkt op andere chromosoom
functie regulatoir element achterhalen
vervangen gen door reporter gene
of mutant door verwijderen
in hoe veel reading frames kan dna getransleerd worden
6
in heo veel reading frames kan rna getransleerd worden
3
hoe wordt translatie beeindigt
`release factor met peptidyltransferase bindt A site, hydrolyse wardoor ketting loslaat van tRNA en ribosoom
verlenging translatie hoe
EF-Tu katallyseert binding van aminoacyl-tRNA aan ribosoom
EF-Gu coordineert translocatie van A naar P en P naar E
vorming peptide bond tussen n terminus van amino aan tRNA en c terminus van nascent chain
verschil translatie eukaryoot en prokaryoot
eukaryoot; heeft pre initiation complex en cap binding. scannen mRNA tot startcodon vanaf daar in kozak consensus sequence
prokaryoot; internal initiation of translation
verschil co translational en post translational
co - tijdens translatie in ER
post - na
hier worden ze geglycoliseerd
hoe wordt vouwing proteins gecorrigeerd
hsp70 helpt tijdens vouwen door hydrofobe interacties. binden van ATP en GroES laat protein vrij
hsp60 corrigeert
F box target naar E2E3 indien fout
EcoRI werking
knipt zo dat sticky 5 overhang blijft
HpaI werking
blunt end
isochizomers
enzymen die zelfde sequence herkennen
GATEWAY strategie
gebruikt recombinatie sites ipv restrictiesites
laat DNA tussen verschillende vectors springen terwijl reading frame behouden blijft mbv LR clonase:
entryclone heeft DNA dat je interessant vindt omringd door attL
destination vector heeft twee attR sites
LR clonase zorgt voor recombinatie tussen sites en creeert nieuwe AttB site in vector, en attP in donor
terug te draaien met BP clonase
waaraan moet een general vector voldoen
voor introductie gen, daarom gene of interest en selection marker
waaraan moet een knock out vector voldoen
homologous DNA sequence - zodat gen verwijderd wordt van genomic DNA door homologous recombination
een positieve selection marker tussen homologous- onderscheid ko en wt (zoals neomycin resistentie)
negatieve selectiemarker buiten homologous - expressed dan random geintegreerd (zoals tk1/2 die gedood kunnen worden door ganciclovir)
genome editing mogelijkheden
zinc finger - restriction enzyme bindt DNA, cleavage
herkennen 3 base pair
talen nuclease - binden niet specifiek, herkennen een nucleotide
crispr cas9 - guide rna is complementair/homoloog, bindt cas9 wat silence/mutation ontstaat
gene therapy SCID
retroviral gene construct in LMO gene, maar gaf leukemie
AVV vector
integreren niet in host maar persisteren als episoom - langdurige expressie
manieren om DNA sequentie te bepalen
dideoxy
hierarchical shotgun
pyroseq
illumina
ION torrent
minION
bioNano
PCR
RTPCR
AFLP PCR
manieren om RNA expressie te meten
RNA seq
microarray
northern blot
QPCR
reporter gene vervangen/verwijderen
manier om eiwitten te meten
2d gel
MS/MS
PDB
waar metabole paden op te zoeken
kegg
DNA gebonden eiwitten zichtbaar maken
chemical/enzymatic degradation
mobility shift assay
genome editing mogelijkheden
zinc finger
talen
crispr cas9
