mboc - week 2 Flashcards
Epigenetic regulation
Heritable change in gene expression or genome function, door mitose gene expression and expression states (vooral planten) veranderlijk. Door meerdere delingen doorgeefbaar maar omkeerbaar
If epigenetic regulation goes wrong consequences
disturbed development, diseases, transgene silencing, faster aging
In ratten epigenetische regulatie invloed –
likken geeft verwijdering methylatie en meer expressie glucocorticoid receptor (stress)
Epigenetische modificaties
- Noncoding RNA
- Histone variant (structure nucleosome)
- Histone modifications
- DNA methylations
Bekende mutaties bij chromatinesoorten:
Heterochromatin: H3K9me
Euchromatin active: H3K4me3
Euchromatin inactive: H3K27me
Genome always off modifications;
DNA methylation, H3K9methylation, transposons
Genome active temporarily modifications;
RNAP2, activator, H3k4methylation, histonacetylation, genes
Genome inactive temporarily modifications;
H3K27, repressor proteins, genes
euchromatine wanneer open en wanneer niet
H3ac, H3K4me, activator/trithorax protein open
repressor/polycombgroup (PcG) proteins, H3K27me dicht
wat nodig naast epigenetische modificatie -
sequence specific transcription factors en chromatin remodelling nodig omdat niet alles in een keer open moet
Transposable element
change position in genome, regulates gene expression, can multiply itself
Saccharomyces cerevisiae voordelen en nadelen
deelt snel en aseksueel, makkelijk onderhouden, homologous recombinations, tiny genome
geen DNA methylation, H3K9methylation, geenH3K27 methylation, no RNAi, unicellar, few TE and distal CREs
Schizosaccharomyces pombe voordelen en nadelen
H3K9me, RNAi
geen DNA methylation, H3K9methylation, geen H3K27 methylation, unicellar, few TE and distal CREs
Caenorhabditis elegans voordelen en nadelen
H3K27me/polycomb silencing, multicellular
geen DNA methylation, few TE and distal CREs
Drosophila melanogaster voordelen en nadelen
betekenisvolle phenotypische veranderingen
geen DNA methylation, few TE and distal CREs
Arabidopsis thaliana voordelen en nadelen
DNA methylation, lots of variants
not as many TEs as organisms with large genome
Wat is DNA methylation, waar geplaatst
5-methylcytosine (5mc) in meeste eukaryoten, vooral cytosine in CG context.
* Transposable elements have DNA methylation, samen met H3K9
* CpG rich ‘islands’/Promoters are unmethylated
* Protein-coding regions have DNA methylation in gene body
Heel groot deel 5mc in transposons en repetitief DNA
trekt DNAmethyl binding proteins (MBPs) aan
5hydroxymethylcytosine
zorgt voor activaite enhancers, eerste stap in verwijderen 5mc
voorkomt MeCP2 binding en TET voorkomt DNMTs
Methylated cytosines ways of repression
Inibition of TF die RNAP stimuleren
Methyl binding proteins (MBPs) bind 5mC & recruit repressor proteins (e.g. H3-K9 methyltransferase) to repress transcription
DNA methyltransferases (DNMTs) are bound to histone deacetylases (HDACs) and histone methyltransferases (HMTs), resulting in transcription inactivation
Methylation meten voor specifieke regios waarmee
- DNA blot analyse
- qCPR
- bisulfite sequencing
genome wide methylatie meten waarmee
- immunolabeling
- IP met 5mc antilichaam samen met qPCR/microarray/sequencing (me-DIP)
- Sequencing DNA methylation libraries
- Genome wide bisulfite
- Genome wide enzymatic methyl seq
MeDIP
gefragmenteert DNA, 5mc antilichaam er bij en groen fluor, ander deel rood (dit is niet gemethyleerd), magnetische beads om die er weer uit te halen, daarna sequencen om te kijken welke sequences zijn enriched
Bisulfite sequencing
analysis of methylation of every cytosine in DNA. Bisulfite changes unmethylated cytosines into uracil. Gemethyleerd blijft C, niet omschrijven naar dochterstrand!! ACTA BLIJVT AUTA!! PCR en cloning voor klein fragment of sequencing voor heel genoom. Als je top en bottom strand vergelijkt bij dochtercel zie je dat code verandert.
Methylation 5mc afwijkende targets
- Normaal 5’–CG–3’
- In embyryo; 25% non CG, mainly CA
- Mammalian brain 1.5% non CG, mainly CA
- Planten; CG, CHG (H = A,T or C) which is symmetric or CHH which is asymmetric because one C methylation is missing
MeCP2
bindt specifiek aan CA gemethyleerde structuur en is nodig bij x inactivatie. niet werken van dit geeft misregulatie (Rett syndroom)
TAD
blob van DNA. chromatine die gelijke epigenetische markers hebben, sequences daarin binden elkaar. Voorbeeld polycomb silenced, transposons en active genes. Phase separation speelt een rol, IDR (intrinsically disorganised regions) interact
Compartment
TADs reageren weer met elkaar. Phase separation speelt een rol
brain-specific gene in brain and liver type of chromatin –
brain; active euchromatin, liver; factultative heterochromatin - not expressed in liver but not permanently silent.
Constitutive
altijd uit, transposable elements
Facultative
niet altijd uit
accessible active chromatin marks
H3K4me, H3ac, H3K36me, trithorax (activator)
Inactief naar actief nodig
TF + chromatin remoddeling proteins
Geeft methylatie/acetylatie etc op verschillende plekken zelfde effect?
nee, bv K4 en K9 modification geven compleet ander effect
ChIP seq
method to check histone modifications. Ab bij chromatine, beads toevoegen die alleen gekoppeld bindt, DNA isoleren, analyse met PCR (locus), high throughput (whole genome), microarray (niet echt meer gebruikt)
constitutive heterochromatin marks
H3k9me
dna methylation
transposons
hp1
Active euchromatin marks
h3ac
h4ac
trithorax (activator)
h3k4me
h3k36me
RNApol2
genes
Inactive chromatin
H3K27me
polycomb
genes
Plaatsing methylatie histonen
- H3K4me3 piekt in begin
- H3K36me3 piekt na H3K4me3
- H3ac/H4ac minder hoge piek maar houdt langer aan
- H3K27me3 als blanket over hele gen
H3K4me3 kenmerken
- H3K4me3 recruits histone acetyl transferases (HATs)
- Level of H3K4me3 mark correlates with transcript levels
- H3K4 methylation prevents DNA methylation
komt vooral op promotors voor
voorkomt methylatie maar kan er niet af halen
Welke histonmodificaties zijn belangrijk voor genactivatie en transcriptie–
H3ac, H3K4me en H3K36me
How does H3K4me results in active chromatin?
Recruits acetyltransferases, prevents DNA methylation
DNMT3 – de novo DNA methyltransferase
DNMT3L – DNMT3 binding partner
H3k36 rol
voorkomt cryptic initiation of transcription
* acetylation is added co-transcriptionally by HAT: facilitates disruption nucleosomes by RNA Pol II
* H3K36me added behind RNA PolI complex: recruits Histone deacetylase (HDAC) -> removal Histone acetylation
* H3K36me recruits DNMT3 -> de novo DNA methylation (5mC)
* Kortom; Verwijderd acetyl, minder acceccible, meer stabiel. Methylation voorkomt initiatie
komt vooral voor in gene body
H3k27me3 rol
speelt blenagrijke rol in silencing developmentally/tissuespecifically regulated genes
mutatie lysine naar methionine voorkomt vorming polycomb - glioma
H3K9me rol
is associated with silencing of transposable/repeated elements vooral samen met HP1
verwijderen van h3k9 methyltransferase geeft minder genome stability, deletions, translocations
hoe worden on en off state behouden
Polycomb maintains off state (h3k27me), trithorax on state (h3k4me, h3k36me)
Bivalent/poised
aan en uit signalen op zelfde moment. Vooral stem cell
komt door combinatie h3k27me en h3k4me
Acetyolation writer =
HAT/KAT on lysine
Acetylation eraser
HDAC on lysine
Methylation writer
HMT-KMT on lysine/arginine
Methylation eraser
HDM/KDM on lysine/arginine
Fosforylation writer
kinase on serine
Fosforylation eraser
PPTase on serine
Ubiquitine writer
ligase on lysine
Ubiquitine eraser
protease on lysine
histone modifying enzymes recruitment –
sequence specific transcription factors such as GATA3, MyoD. Sequence specific TFs herkennen DNA sequences, determine how important that sequence is for those transcription factors.
Overexpression EZH2 in polycomb
silencing tumor supressor genes such as INK4A and CDKN1A. it mediates H3K27me2/3, removal acetyl
Histone variant
proteins with different aminoacid composition than standard histones. Encoded by different genes than standard/canonical. Differ in amino acid. Differ in properties, expressed throughout celle cycle, desposited replication independent, encoded by individual genes, contain introns, polyadenylated transcript AANVULLEN
canonical histone expression when
during s phase
Verschil histone variants tov total pool voor H3 en H2A
in mammalian cells the contribution of histone variants to the total pool of histone proteins is bigger for H3 than H2A histones
Functie H3.1
present in bulk of chromatin
tijdens replicatie door CAF1
Functie H3.3
vervangt verloren histonen, mogelijke rol in transcriptie initiatie. Ook op telomeric repeats en pericentric consitutive hemochromatin
vooral dus in actief chromatine, replicatie onafhankelijk. door HIRA in genen/regulatoir en door h3k9me DAXX-ATRX in repetitief/hetero gezet.
cenH3 (CENP-A)
is heel anders dan H3.1 en H3.3, zit bij centromeer waar spindle connect chromosomen. Kinetochore structuur assembly
How can the location of cenH3 be explained?
CenH3 and H3 incorporation at centromere alternates and chromatin forms helical turns
With whick type of chromatin is H3.3 associated?
Actively transcribed genes. Te zien aan RNApol2 en H3K4me2
CAF1
zet H3.1 neer tijdens replicatie
HIRA
zet H3.3 op genen en regulatoire sequences
DAXX
zet H3.3 op repetitief DNA
Knock out HIRA effect
geeft minder dense, meer schade DNA, limiteert nieuwe methylatie en cryptic initiation of transcription
Waarom H3.3 in pericentric consitutive heterochromatin
in repeated sequences histones can be lost
Mutation in H3.1/H3.3
geeft hersentumoren. Lys27 > met27 veroorzaakt doordat enzymatic activity of PcG proteins is hamered, facilitating gene expression. Lys27met geeft minder polycomb voor trimethylatie h3k27, minder activiteit EZH2, minder tumorsupressoractiviteit.
waarom kunnen H3.1 en 3.3 zomaar worden ingebouwd op elkaars plaats?
Minor amino acid differences between H3.1 en 3.3 allow replication independed incorporation of H3.3
incorporation of H3.3/H4 door welk protein
ATRX-mediated binding to H3K9me3. DAXX incorporates H3.3-H4 dimers
macroH2A functie
X inactivation door coaten met xist RNA wat silencing geeft
verdere silencing door h3k27me en polycomb group proteins (pcg)
modificatie h3/4 naar macroh2a
5mc aan 5 einde genen geeft irreversibele inactivatie
heeft een groot c terminal domain dat uitsteekt wat remoddeling voorkomt
geassocieerd met HDAC
werkt als tumorsupressor
H2A.B functie
Boundary sequence – prevents heterochromatin from spreading, prevents enhancer from activating gene.
rol in mRNA splicing
short c terminal, geen amino acid targets for modification.
less stable -> increase in chromatin accessability.
Excluded from inactive x chromosone, enriched at active. Vooral in testis, ook andere organen. vooral in tss. co localizes met h3
H2A.Z functie
conserved in eukaryote development. Extended acidic pathch domain wat deel is van docking domain dat interactie met andere histonen beinvloedt.
Regulates gene transcription door RNApol recruit. SWR-C zet H2A-Z-H2B in NDR/NFR zoals TSS
boundary/insulation - voorkomt enhancer activatie, voorkomt heterochromatine spreiding
chromosome segregation
Relatie tussen H2A.Z en DNA methylatie
reversed, anticorrelation. Is bij transcription start site te zien
De novo methylatie waardoor
DNMT3 – methyleert de novo n terminal lysine 4, DNMT3L = DNMT3 binding partner
Active demethylation waardoor
TET
In welke cellen wordt methyl verwijderd -
Progenetor cells en zyoogote
Methylatie in verschillende species soorten
Only CG in mammals, CG, CHG and CHH in plants, no C methylation in Drosophila
Which histone modifications and sequences are generally correlated with the absence of DNA methylation?
H3K4 methylation, transcription start sites and active regulatory sequences
Hoe vindt methylatie tegen cryptic initiation of transcription plaats
- RNA pol2 bindt, Setd2 zit hier aan vast
- SETD2 zet H3K26me achter RNAP2
- DNTM3b (de novo) herkent en methyleert
unmethylation nodig waar
transcription start site CpG islands (beschermd tegen methylation, ookal gaat dat tegen intuitie in). TF is pioneer
how are CpG islands protected? -
H3K4 methylation & binding transcription factors, en enzymen voor DNA demethylatie (TET)
How can transposable elements (TEs) threaten genome stability?
Insertional mutagenesis
spreading DNA methylation from TEs
Promoter inactivation
Homologous recombination between TEs
trnascription interference(RNAi)
waar vindt je vooral unmethylated en low methylated regions
Unmethylated vaak om gene, gaat om CpG eiland. Daaromheen is low methylated, cell type specific.
Rol methylatie
TE onder controle (tegen mutagenesis door in intron, of homologe recom door deletie, minder DNA methylatie)
geen homogolous recombination
Genomic inprinting
x inactivatie
gentranscriptie
genome stability
Genomic inprinting
- The DNA of imprinted sequences is methylated
- Genes are expressed in a parent-of-origin manner
- The imprints are reset during gametogenesis
- Genes show monoallelic expression dependent of their parental origin – need to be reset during gametogenesis
Van minst naar meest permanent metylatie plekken-
Xist RNA coating, silencing, macroH2A, DNA methylation
5mc for daignosis
Bloedsample sept9 is gtp binding protein, methylering CpG van SEPT9 is grote kans colonkanker
5mc beinvloedt site at which polyadenylation occurs
sept9 biomarker
Bloedsample sept9 is gtp binding protein, methylering CpG van SEPT9 is grote kans colonkanker
What is the role of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)?
5hmC is an intermediate in the DNA demethylation pathway
How can DNA methylation be lost upon cell division?
- By replication in the absence of DNA methyltransferases (passive demethylation)
- Through removal by TET enzymes (active demethylation
DNMT1 functie
for maintanence methylation, target CG en CHG
DNMT3A/B/C functie
de novo methylation, targets CG/CA/CT/CC
Hemimethylated site
aan andere kant is het nog maintanance. Mocht beide kanten geen C gemethyleerd hebben is het de novo
DNMT1 hoe verzameld
kan komen door op replication form te gaan zitten of door zinc finger
piRNA
in germ cells de novo methylattie van TE -> recruit DNMT
passive DNA demethylation
door replicatie heeft helft geen methyl
active DNA demethylatioin – TAT, kan ook zonder replicatie
waarom altijd meteen mannelijk DNA ge unmethylated na bevruchting
beide kopieen aanwezig, beide expressed zou growth problems geven, daarom DMRs moeten gemethyleerd blijven in zygote
IncRNA function
gene regulation, x inactivation, genomic imprinting,
microRNA funciton
fine tuning gene expression
coderen voor longRNA die weer coderen voor miRNA
perfect match - degradation, mismatch - translation inhibition
kan mirtrons maken - moeten gespliced ipv drosha
long-non coding RNAs kenmerken
RNAs from intergenic regions that are at least 2kb long. Bevatten meestal wel ORFs voor microproteins, maar meestal niet translated. Door RNAp2 gelezen, gecapt en polyA. Tot expressie cel/weefsel/ziekte specifiek. Kunnen gemaakt worden uit intron, coding, cis regulatoire regios.
circRNA kenmerken
closed loop. Door back-splicing met downstream splice site joining upstream splice site, heel stabiel, niet exonuclease mogelijk. Sequestering microRNAs or proteins.
enhancerRNA (eRNA) kenmerken
komt vn enhancer af, bidirectional, capped, unspliced, niet polyA, instabiel
enhancer associated inRNA (elncRNA) kenmerk
meestal unidirectional
long non coding RNA categorieen
- niet-functioneel – transcriptional noise
- non functional waarbij transcription process sufficient for function
- functional die cis of trans werking kunnen hebben. Bijvoorbeeld Xist, Tsix, HOTAIR ONTHOUDEN
wat gebeurt er bij transcriptie twee kanten tegelijk op
interference
gebeur tbij lncRNA
wat gebeurd er bij binden aan polycomb proteins
transcriptional repression
Decoy model
lncRNA bindt aan activator, protein complex laat los
voorbeeld gas5
guide model -
Protein binds dna, makes it that protein can bind the targer. LncNRA bindt activator, conformational change, allowing binding protein
Scaffold model:
lncRNAs can, by binding, bring multiple proteins together in a complex that together exert a particular function
voorbeeld HOTAIR bindt PRC2 en H3K4me2/3 demethylase, zorgt voor H3K27me3 en verwijderen H3K4me2/3 - repressie in trans
voorbeeld xist RNA coat x en recruit polycomb. tsix voorkomt opstapeling xist
voorbeeld ncRNA a7 voor trnscription factor
voorbeeld HOTTIP guides H3K4methyltransferase naar TSS
Xist –
scaffold lncRNA, coats chromosome, dosage compensation; niet twee keer meer dosis door vergeten x uit te schakelen
Functie lncRNA bepalen
knockdown door smallRNAs. Niet met crispr omdat je dan enhancerregio er uit zou halen, kan je niks meer zeggen over specifieke functie lnc RNA. Kan met bijvoorbeeld ncRNA-a7 of HOTTIP, geeft decreased expression
RNAi general characteristics (small RNA pathway);
dsRNA wordt hetkend door dicer en geknipt in stukjes van 20-30bp tussen PAZ en catalytic residues, die stukjes op ARGONAUTE in RISC complex gezet en uit elkaar getrokken waarbij een strand overblijft (antisense), wordt geplakt aan mRNA, waardoor mRNA geknipt wordt. Geeft silencing, translation inhibition, heterochroma. Sequence specific
IR transgenes
produce dsRNA
gevolg dat planten veel kleurcombi’s hebben. Kan een hairpin vormen
Sources of dsRNA
inverted repeat transgene
endogenous microrNA
sense and antisense van zelfde sequence
externally
viral RNA
action of RNA dependent RNA polymerase
transposable element
sense en antisense van zerlde sequence
miRNA functie
fine tuning expression
developmental regulation
biomarker
piRNA functie
inhibition TEs transposons
genome stability
germline development
transcriptional (TGS) silencing
transcription is hampered
post-transcriptional gene silencing (PTGS)
RNA is degraded or translation blocked
What are the components (nucleic acids and proteins) of the microRNA pathway?
Pre miRNA drosha, exportin 5
PTGS welke soort RNA –
miRNA, piRNA, siRNA.
Transcriptional of posttranscriptional RNA block testen
- RT(Q)PCR of blotting – kijken of er RNA is. Geen RNA dan niet betekent dat het erniet is. Dan run on transcription assay
- Wel RNA dan western blotting of immunolabeling
microRNA pathway -
dsRNA pri-mi RNA gemaakt, Drosha knipt poly A en cap waardoor pre-miRNA ontstaat. Exportin 5 stuurt het uit de kern naar dicer, short double stranded geladen op RISC, enkele streng bindt daardoor aan mRNA. miRNA gecodeerd door endogenous genes.
miRNA kan gevonden worden in bloed, daarom gebruikt als biomarker
piRNA pathway –
piRNA cluster gets trnscribed
processing
loading into PIWI
transport uit nucleus
piRNA bindt TE RNA (secondary piRNA)
knippen TE
TE kan weer TE/piRNA herkennen, ping pong cycle
siRNA kenmerken
tegen virussen in plant, worm, insect. In mensen ook aanwezig; alleen in early development stage, IFNI later.
siRNA als behandeling – in nanoparticles tegen degradatie en om zeker te zijn van opname
repression viral expression and TE. RNA decay of translational silencing
voornamelijkste reden dna methylatie in transposons
voorkomen van insertional mutagenesis. zo;n 45% bestaat uit transposable elements
threatens genome stability als dit niet wordt gedaan
is een lethal mutation vaak niet lethal in een groot of klein genoom?
klein
waarom kan methylatie een biomarker zijn
meer methylatie bij kanker - repressie van kankerremmend gen
op welke histonstaart vooral modificaties
n terminal histone tails
cross talk set1
set1 methyleert h3k4
h3k4 faciliteert binding nuA3 HAT
H3k14 wordt geacetyleerd3h3k4
H3K4me1 locatie
enhancers
effect acetylatie
tf bindt en neemt HAT mee
expression of canonical and non canonical histones
canonical - during s phase
non canonical - replication independent
welke histone variants komen overal voor, welke alleen bij vertebrates
overal; H3.3, cenH3, H2A.x, H2A.Z
alleen in vertebrates; macroH2A, H2A.B
waar is replicatie coupled deposition van histonen van afhankelijk
aminozuren van n terminal
H2A.X functie
is voor DNA reparatie, random ingebouwd In alle eukaryoten. Soms de vervanger voor H2A. Serine at c terminal extension; phosphorylated upon DNA damage.
targets van dna methylatie
transposable/repeated
gene bodies
nucleosomal dna
non targets van dna methylatie
h3k4me - voorkomt DNMT3, dus geen de novo methylatie
TSS en 3 end - dan stopt initiation
active promotors/regulatory
CpG island at promotor
enhanser/insulator
waarop wijzen low methylated regions
distant enhancers, kan celspecifiek zijn
waarop wijzen unmethylated regions
CpG island
`reden van dna methylatie
genome stability
gene regulation
x inactivation
gene transcription regulation
DNMT3a/b
komen vooral voor in ESC waar ze CHH methyleren, maar vooral CG (soms non CG) worden gemethyleerd
lncRNA functie
generegulation
genomic imprinting
x chromosome inactivation
lncRNA kenmerken
langer dan 200nt
non coding maar wel cryptic ORF
niet vertaald
transcribed, capped, spliced, polyadenylated
korter en minder expressed dan mRNA
cell tissue en developemntal stage/disease stage specific
active enhancers maken vaak lncRNA (eRNA)
promotor zelfde als coding
run on transcription assay
nuclei isolated radioactively labeled
nucleotiden toegevoegd
rna isoleren en radioactiviteit meten
siRNA pathway
zelfde als miRNA
siRNA functie
beschermen pathogenen
genomic stability (silencing TE)
genome offence
methylatie meten
DNA blot
bisulfite seq
meDIP
histonmodificatie meten
CHIPseq
TGS door welke small RNA
pi en si
patirisan
eerste RNAi drug voor amyloidose bij neuropathie