Luc Oligny - Cours 1 Flashcards
Quels sont les deux types généraux de modalités diagnostiques moléculaires?
Celles qui évaluent l’ADN et celles qui évaluent l’ARN
Que vont évaluer les tests basés sur l’ADN?
La présence d’un gène ou non et la présence de mutation(s)
Quels sont les tests utilisant l’ADN?
Southern, PCR, FISH, CGH, SNP
Quels sont les tests utilisant l’ARN?
Northern, RT-PCR, puces ARN, Western
Quelle est la distinction entre l’ADN génomique et le cDNA?
ADN génomique provient de purification
cDNA provient d’ARNm réverse transcrit
Quel est le principe du Southern blot?
ADN purifié en relativement grande quantité
Digestion avec une ou plusieurs enzymes de restriction
Migration par électrophorèse sur gel d’agarose
Transfert sur membrane
Détection par sonde (hybridation)
Stringence vs. permissivité
Stringence si les paramètres empêchent l’hybridation à moins d’un appariement parfait
Permissivité si la sonde peut s’apparier avec des mismatchs
Expliquer comment évaluer de façon semi-quantitative un gène, par exemple dans une tumeur.
On hybride la membrane avec 2 sondes, dont une qui reconnait un gène à copie unique.
On compare ensuite l’intensité du signal du gène d’intérêt avec ce témoin.
Quels sont les inconvénients du Southern?
Nécessite de nombreuses manipulations: long et coûteux
Plusieurs étapes sont très longues et séquentielles, un diagnostic rapide est donc impossible
Besoin de beaucoup d’ADN
Qu’est-ce qui explique les différences de taille entre les sites de restriction? (RFLP)
Séquences répétées (ALU, LINE, SINE, microsatellites, etc)
Quelles sont les caractéristiques du dot blot?
pas de digestion nécessaire pas d'électrophorèse nécessaire peut évaluer des centaines d'échantillons d'un coup hybridation sur membrane évalue présence/absence
Quel est le principe du Northern blot?
Extraction d'ARN cellulaire pas de digestion! migration par électrophorèse transfert sur membrane détection avec sondes marquées
Quelle est la principale utilité du Northern blot?
Étude des gènes transcrits (exprimés) dans un tissu spécifique, par exemple une tumeur
Quel est le principe du Western blot?
migration de protéines sur gel
transfert sur membrane
détection par anticorps
Quel est l’avantage de l’immunohistochimie par rapport au Western?
Détection du type cellulaire et de la localisation de la protéine
étapes d’un cycle de PCR
95C -> dénaturation
60C -> hybridation des amorces
72C -> synthèse par polymérase
À quoi sert le RT-PCR?
déterminer si un gène est transcrit en ARNm
Quels sont les avantages du PCR par rapport au Southern?
diagnostic en quelques heures
nécessite de très petites quantités d’ADN
peut être multiplexé
peu dispendieux
Quelles sont les limites du PCR?
séquence des amorces doit être connue
amplification limitée à environ 1000bp
Que permet le Q-PCR?
Évaluer le nombre de copies d’un gène dans un échantillon
Quel est le principe de FISH?
hybridation fluorescente in situ
à partir de noyaux étalés sur lame
Expliquer les sondes de séparation
deux sondes de couleurs différentes (normalement adjacentes)
fusion des signaux s’il n’y a aucun réarrangement
utiles pour savoir si un gène est réarrangé sans considération pour le gène partenaire
Expliquer les sondes de fusion
deux sondes de couleurs différentes
chacune marque un gène d’intérêt
la fusion des gènes par réarrangement fusionne les signaux
utiles pour démontrer une translocation impliquant deux gènes en particulier
Quelles sont les trois catégories de translocations oncogéniques?
Perturbation d’un gène suppresseur de tumeur
Couplage d’un promoteur actif avec proto-oncogène
Formation d’une protéine chimérique
Les segments remaniés du chromosome du sarcome de Ewing sont trop éloignés pour permettre la détection par PCR. Comment détecter la translocation?
RT-PCR avec l’ARNm chimérique
Comment peut-on déterminer l’expression d’un ou plusieurs gènes?
RT-PCR quantitatif sur micropuce CGH
Comment diagnostiquer le bon virus chez un patient avec 2 souches très semblables dans un hopital?
PCR
Comment résoudre problème de paternité?
RFLP
Comment déceler présence bactérienne dans un expectorat?
PCR
