Lezione 4: Enzimi Di Restrizione, Elettroforesi, Denaturazione E Ibridazione DNA, RNA Profiling Flashcards
Cosa sono gli enzimi di restrizione?
Sono enzimi che tagliano la sequenza del DNA (interrompono la sequenza zucchero-fosfato di un filamento) senza aprirla perchè riconoscono delle specifiche sequenze bersaglio
Quanto sono lunghe le sequenze bersaglio degli enzimi di restrizione?
Da 4 a 8 nucleotidi
Che tipo di sequenze riconoscono gli enzimi di restrizione?
Sequenze palindromiche (Le sequenze che si leggono uguale in direzione 5’-3’ su una catena e in direzione 5’-3’ sull’altra catena, che però è
antiparallela)
Qual è la struttura degli enzimi di restrizione?
-sono omodimeri (infatti riconoscono delle sequenze simmetriche e per questo anche loro sono simmetrici)
Cos’è il k-mer?
-K-mer è una sequenza di “k” basi
(Es.una sequenza di 4 basi è un quattromero,
una sequenza di 5 basi è un pentamero e così via)
Come faccio a calcolare la probabilità di trovare un sito di restrizione di un enzima?
La posso trovare in base alla lunghezza della sequenza riconosciuta dall’enzima di restrizione.
In particolare
Cos’è il sito di restrizione di un enzima?
La sequenza palindromica che riconosce l’enzima di restrizione
Quale utilità hanno gli enzimi di restrizione per i batteri?
Diminuiscono la capacità dei virus di infettare i batteri.
Infatti i batteri, riconoscendo il DNA dei virus che li infettano, riescono a rompere a pezzettini il genoma del virus
Qual è la probabilità di trovare una sequenza di 17 basi in tutto il DNA?
Una sequenza di 17 basi è unica nel genoma umano (1 volta in tutto il DNA)
Cos’è l’elettroforesi su gel?
è un metodo per separare tra loro i frammenti di DNA dopo che quest’ultimo è stato tagliato dagli enzimi di descrizione sulla base della lunghezza del frammento
Come funziona l’elettroforesi su gel?
-ogni nucleotide del dna ha una carica negativa (data dal gruppo fosfato) per questo la lunghezza del frammento di DNA è direttamente proporzionale alle cariche negative che contiene.
-il frammento più lungo migra verso il polo positivo (anodo) più lentamente di uno più corto, per questo dopo un determinato intervallo di tempo i frammenti di DNA si dispongono su bande contenenti frammenti di uguale lunghezza
Che tipo di gel uso per separare tra loro frammenti di DNA con
-più di 500 nucleotidi
-meno di 500 nucleotidi
-più di 500 nucleotidi—->gel di agarosio
-meno di 500 nucleotidi—-> gel di poliacrilammide
Dimmi 2 cose sull’elettroforesi a campo pulsante
-è una variante dell’elettroforesi su gel di agarosio
-permette di separare frammenti molto lunghi (anche quelli che si trovano su interi cromosomi)
Come funziona l’elettroforesi a campo pulsante?
-mentre nell’elettroforesi su gel di agarosio il campo elettrico è costante, nell’elettroforesi a campo pulsante il campo elttrico cambia periodicamente la sua direzione.
Per questo il frammento di DNA si deve riorientare a seconda della direzione del campo elettrico (questo riorientamento avviene più lentamente nei frammenti più lunghi)
Dimmi 2 modi per rendere visibili le bande di DNA durante l’elettroforesi su gel?
1) immergere il gel nel colorante bromuro di etidio, che emette fluorescenza sotto luce ultravioletta quando è legato al DNA.
2)inserisco un radioisotopo o un marcatore chimico nei frammenti di DNA
Quali sono i 2 punti della doppia elica da cui parte la denaturazione del DNA?
-punti in cui ci sono tante coppie A-T (contengono solo 2 legami a H)
-estremità della catena (sono più deboli perchè le basi azotate all’estremità possono formare legami pi-greco solo con le basi sotto di loro perchè al di sopra non ce ne sono)
Qual è l’andamento della curva di denaturazione del DNA
Curva sigmoidale
(-Il plteau rappresenta la temperatura alla quale avviene la denaturazione completa
-il centro della curva è detto temperatura di melting (TM)
Cos’è la temperatura di melting (TM)?
È la temperatura alla quale si ha il 50% di probabilità di avere le due emieliche del DNA unite e il 50% di probabilità di avere le 2 emieliche di DNA separate
La capacità del DNA di assorbire la luce ultravioletta aumenta o diminuisce se quest’ultimo viene denaturato?
Aumenta (perchè tutte Ele basi azotate sono esposte e quindi possono assorbire la luce ultravioletta)
La denaturazione del DNA dipende dalla concentrazione del DNA?
-se la denaturazione avviene da una bassa temperatura ad una alta temperatura—-> è indipendente dalla concentrazione
-se la denaturazione avviene da una alta temperatura ad una bassa temperatura—-> dipende dalla concentrazione delle molecole di DNA
Dimmi 4 fattori da cui dipende TM (e quindi la denaturazione del DNA)
-dalle basi azotate che costituiscono la sequenza—->più CG ci sono, più ci sono legami H ci sono, quindi la temperatura di melting sarà più alta
-dalla lunghezza della catena (questo vale per sequenze più corte di 25 basi)—->a seconda di quante interazioni π ci sono tra le basi azotate la TM può variare
-presenza di sali in soluzione—->se ci sono dei sali (cationi) in soluzione (la repulsione dei fosfati viene schermata parzialmente, così aumenta la stabilità della molecola e la temperatura di melting sale)
-aggiunta di composti caotropici (come la formalmide o l’urea)—->sono in grado di destabilizzare la struttura del DNA (es.favoriscono la formazione del DNA a singolo filamento) abbassando la temperatura di melting.
Quanto vale TM per sequenze con
-12 basi
-16 basi
-20 basi
-oltre 25 basi
-12 basi—-> 40 gradi
-16 basi—-> 45 gradi
-20 basi—-> 55 gradi
-oltre 25 basi—-> quasi nulla?
Cos’è lo stem-loop?
-è una struttura secondaria che può formarsi nelle sequenze palindromiche di acido nucleico (come DNA o RNA).
In particolare una sequenza palindromica di basi si appaia su sé stessa (tramite legami π), creando una struttura a doppia elica in una parte della sequenza (lo stem) e una regione di basi non appaiate che forma un anello/ansa (il loop).
Dimmi un esempio di stem-loop
TRNA—-> la molecola è a singola catena, ma si ripiega su sè stessa andando a formare una struttura a quadrifoglio
Cos’è lo pseudo nodo nello stem loop?
Le basi non appaiate nello stem-loop, se trovano delle basi complementari da un’altra parte della sequenza, formano un appaiamento detto pseudo nodo (perché assomiglia a un nodo aggrovigliato, ma non è annodato e si può srotolare facilmente)
Perchè si può formare uno pseudo nodo nello stem-loop?
Perchè la tendenza delle basi ad appaiarsi tra loro è molto forte
Cosa succede alla TM se c’è un difetto nell’ appaiamento delle basi azotate complementari nello stem-loop?
La TM diminuisce perchè diminuisce la stabilità della struttura
In cosa consiste la denaturazione del DNA?
La rottura della doppia elica tramite la rottura dei legami a H tra le basi azotate complementari (questo avviene a temperature di circa 90 gradi)
Cos’è l’ibridazione del DNA?
È la rinaturazione del DNA (ossia si riformano i legami a H tra le basi azotate complementari dopo che è avvenuta la denaturazione del DNA)
Dimmi a cosa può servire in laboratorio l’ibridazione del DNA
Permette di rintracciare specifiche sequenze nucleotidiche (di norma di 30 nucleotidi) nell’intero DNA
Dimmi i 3 passaggi con cui avviene l’ibridazione del dna in laboratorio
1)si realizzano delle SONDE o PROBE—-> ossia *DNA a singolo filamento,
*lungo circa 30 nucleotidi (perchè così la probabilità di ritrovare tale sequenza in tutto il DNA è di (1/4)^30 ossia 1 volta su 4^30), *complementare alla sequenza nucleotidica di interesse
2)si denatura il DNA ((alzo la temperatura a 90°)
3) Abbasso la temperatura per far appaiare la sonda alla sequenza nucleotidica di interesse: in particolare parte della sonda si ricollega a sé stessa, un’altra parte lo fa col
campione perché è perfettamente complementare a quest’ultimo (si ottiene l’etero duplex)
-
A cosa può servire, da un punto di vista diagnostico, l’ibridazione del DNA per individuare una specifica sequenza nucleotidica?
Per diagnosticare patologie legate a mutazioni del genoma
(es.a anemia falciforme)
Come posso capire se un individuo è affetto da anemia falciforme sfruttando il metodo dell’ibridazione del dna?
L’anemia falciforme comporta all’appaiamento dei globuli rossi all’interno dei capillari, portando alla morte perché la persona non è più in grado di respirare.
Essa dipende da una mutazione nell’emoglobina—-> in particolare i pazienti affetti
da anemia falciforme presentano la sequenza con Adenina, mentre i pazienti non affetti presentano la stessa identica sequenza con Guanina.
Si usa un probe contenente la G: se si appaia con il DNA della persona, vuol dire che la persona in questione è affetta da anemia falciforme, altrimenti, se non è in grado di appaiarsi, vuol dire che la persona considerata non è affetta.
Qual è l’utilità dell’RNA profiling?
È una tecnica che permette di condurre un’analisi dell’espressione genica (ossiaottenere informazioni precise sull’attività genica di una cellula o di un tessuto) rivelando se un gene
-è espresso,
-quanto è espresso
-se ci sono mutazioni o altre anomalie.
Questo può essere usato per monitorare lo stato di salute del paziente e per identificare eventuali malattie o risposte a trattamenti.
Come funziona l’RNA profiling?
1) sintetizzo le sonde di DNA (devono essere complementari all’mRNA che porta il gene che codificherà per la proteina di interesse)
2) prendo l’mRNA derivante dal DNA da analizzare e lo trasformo in cDNA (DNA complementare) per mezzo della retrotrascrizione
3)rendo fluorescente il cDNA da analizzare e lo aggiungo alla soluzione.
A questo punto se il DNA da analizzare
-si ibridizza con la sonda—-> non c’è alterazione della sequenza
-non si ibridizza con la sona—-> presenta una mutazione della sequenza
Cos’è e in cosa consiste il metodo Southern Blotting?
-È una tecnica precursore dell’ibridazione del DNA in laboratorio
PROCESSO
1) Il DNA viene frammentato
attraverso gli enzimi di restrizione
2) ilDNA viene fatto correre in un gel di agarosio, avviene l’elettroforesi distribuendo i
frammenti su bande
3) si trasferiscono i frammenti di DNA dal gel a un foglio di nitrocellulosa sfruttando la capillarità.
4) Si mette a contatto il DNA dea analizzare con una sonda marcata radioattiva
che consiste nella sequenza di DNA o RNA
complementare a quella cercata. Se è presente una
mutazione, questa viene evidenziata.
