Laboratório de Nutrição Flashcards
O que se investiga na área da alimentação animal?
- Manipulação genética (técnicas de DNA recombinante) de celulases e hemicelulases em procariotas - Caracterização/função específicas e futura utilização na suplementação de dietas para animais monogástricos
EX: Aves, já que atingem o fim do seu crescimento rapidamente - Estudo de estruturas celulossomas de bactérias anaeróbias
- Resolução estrutural de proteínas - Cristalografia de proteínas
O que é a biomassa vegetal?
Toda a matéria orgânica de origem vegetal (destacando-se as paredes celulares vegetais), utilizada por diversos microganismos (bactérias, fungos) para produzir energia que pode ser canalizada para:
- Metabolismo digestivo (herbívoros)
- Indústrias (alimentos, papel, detergentes)
- Biocombustíveis (bioetanol)
O que são celulases e hemicelulases?
Enzimas produzidas por diversos organismos, dos quais destacamos as bactérias celulolíticas, e que são capazes de degradar a celulose e a hemicelulose
O que é a parede celular vegetal?
Estrutura das plantas que alberga 40% celulose, 30% hemiceluloses, pectina, linguina e proteínas solúveis
Difícil degradação, daí o papel crucial das celulases e hemicelulases
O que caracteriza a celulose?
Principal composto orgânico na biosfera
Polímero de cadeia longa, composto por monómeros de b-D-glucose, unidos por ligações glicosídicas beta (1,4)
A celobiose é a unidade que se repete ao longo de toda a cadeia
Estrutura cristalina
Altamente recalcitrante
O que caracteriza as hemiceluloses?
Heteropolímeros amorfos, altamente ramificados (com cadeias laterais), complexos e intimamente associados à celulose e à lenhina
Apresentam-se na forma de:
1. Xilano - Cadeia linear muito ramificada, com unidades repetitivas de xilose unidas por ligações glicosídicas beta (1,4)
2. Pectina - Fibra solúvel (gelificante natural)
3. Lenhina - Componente ligado à celulose e que confere resistência aos tecidos, a ataques microbiológicos e mecânicos
Quais as diferenças entre bactérias celulolíticas aeróbias e anaeróbias?
Aeróbias:
- Fácil manipulação
- Secreção de enzimas exógenas que atuam em conjunto com outras (géneros Celvibrio, Micromonospora, Pseudomonas) - Sinergismo enzimático
- Solo (biomassa vegetal)
Anaeróbias:
- Manipulação complexa
- Secreção de complexos enzimáticos específicos - Celulossomas
- Solo (Clostridium thermocellum) e rúmen (Ruminococcus flavefaciens e bacteroides)
Qual a estrutura das enzimas celulolíticas?
Carácter modular
EX: Celulase
Péptido de sinal - SP
Módulo catalítico - Glicósido hidrolase (GH)
Módulos ligação hidratos de carbono - CBMs
Módulos de função desconhecida - MFD
Módulos de ligação (conferem uma estrutura maleável à enzima) - L
Como se determina a função das enzimas celulolíticas?
- Determinar as sequências nucleotídicas das enzimas
- Introduzir numa base de dados
- Comparar com outras sequências de função conhecida - Alinhamento sequencial nucleotídico (Blast)
- Obter homologia sequencial (Multalin) com enzimas semelhantes de diversos organismos
- Procurar resíduos conservativos (vermelho) e averiguar a sua especificidade
NOTA: Também existem sequências semi-conservativas e não conservativas
Como se faz a catalogação estrutural?
Através da base de dados CAZy - Descreve módulos catalíticos (GH) e módulos de ligação a carbohidratos (CBM) estruturalmente relacionados (por homologia), de enzimas que degradam/modificam/criam ligações glicosídicas
Letras indicam módulos, o 1º número representa a família e o 2º número a sub-família
O que são celulossomas? Como se ligam às células?
Complexos enzimáticos altamente organizados e de grande eficiência na degradação de substratos da PCV, secretados por fungos e bactérias anaeróbias
CipA (proteína de suporte multimodular) + Enzimas de encaixe
Os locais de ligação do celulossoma à célula contêm proteínas de ancoramento:
- Classe I - CBM interno e um módulo de doquerina tipo II na terminação carboxilada
- Classe II - CBM na terminação aminada e sem um domínio de doquerina
- De ancoramento isoladas - Sem CBM
Como se procede a técnica de DNA recombinante?
- Isolar genes codificadores de celulases e hemicelulases alvo
- Clonar genes num vetor específico produtor de proteína, com cauda de histidinas
- Confirmar o tamanho do plasmídeo obtido (eletroforese em gel de agarose) e sequenciar (impedindo mutações)
- Transformar o plasmídeo em E. coli competentes (geneticamente modificadas para incorporarem plasmídeos no seu DNA)
- Inocular em meio de crescimento apropriado (LB) incluindo um antibiótico - Seleção das bactérias resistentes
- Favorecer o crescimento celular exponencial numa agitadora orbital a 37ºC, até que o meio de crescimento com E. coli atinja DO = 0,4 (leitura espectrofotométrica a 595 nm)
- Induzir as E. coli com IPTG, estimulando a produção de proteína e o seu crescimento lento na orbital, a temperatura e rotação inferiores
- Separar células do meio de crescimento LB (centrifugação) e obter o extrato proteico recorrendo a ultrassons
- Verificar a existência da PA no extrato - Gel de SDS de poliacrilamida com proteína desnaturada
- Purificar PA por FPLC - Aparelho com colunas de níquel que prendem a cauda de histidinas das PA (cromatografia de afinidade) e libertam todas as proteínas próprias da E. coli por lavagens sucessivas
- Emissão dum gráfico com o registo das proteínas que se depositaram em diferentes tubos de amostra - As amostras que contêm as PA encontram-se no 2º pico
- Retirar amostra do 2º pico e confirmar a sua pureza com eletroforese em gel de SDS de poliacrilamidada
- Confirmar especificidade da PA através de estudos de ligação enzima-substrato, em géis nativos de poliacrilamida sem SDS e com vários substratos incluídos, utilizando a proteína nativa (estrutura quaternária)
EX:
S/S - Gel sem substrato
Lam - Gel com laminarina
CMC - Gel com carboxilmetilcelulose (celulose solúvel)
ASB - Proteína padrão
O retardamento da mobilidade eletroforética da PA nos géis com Lam e CMC sugere que tem capacidade para interagir com estes substratos - Utilização de celulases recombinantes na suplementação de dietas para monogástricos à base de cereais
Como se dá a desnaturação da proteína?
Obtenção da estrutura primária da proteína:
1. Banho de água a 100ºC durante 5 minutos - Rompimento das ligações
2. Introdução em gel de poliacrilamida com SDS - Formação de pequenos orifícios através dos quais a proteína passa de acordo com o seu peso (por ação do campo elétrico)
NOTA: O SDS também promove a desnaturação
Quais as principais características dos cereais?
Polissacáridos não-amiláceos que condicionam o aproveitamento energético intestinal dos monogástricos
EX: Nas aves provocam perturbações digestivas e
dificuldades no crescimento
Ricos em fatores anti-nutritivos:
1. Beta-glucanos (cevada, aveia)
2. Arabinoxilanos (trigo e centeio)
O que se requer da enzima para que a sua utilização na alimentação animal tenha êxito?
- Degradar substratos alvo
- Resistir ao baixo pH (estômago, moela e proventrículo)
- Resistir às enzimas proteolíticas (quebram as ligações aminoácidos no estômago e duodeno)
- Ativa nos substratos disponíveis do intestino
- Suportar os processos tecnológicos de fabrico do alimento (temperaturas elevadas)
