La chromatographie

Question 1

Quels sont les deux phases sur laquelle la chromatographie est basée?

Answer 1

La phase mobile: mélange de substances à fractionner

La phase stationnaire: les substances sont séparées

Question 2

Quels sont les troistypes et propriétés pour effectuer le fractionnement?

Answer 2

1- les interactions ioniques (chromatographie par échange d’ions)

2- la taille (chromatographie par gel-filtration)

3- la spécificité (chromatographie d’affinité)

Question 3

Les ions se lient électrostatiquement à quoi dans un processus d’échange d’ions?

Answer 3

Un support insoluble. Il peut avoir des échangeurs d’anions et de cations à la fois.

Question 4

L’affinité avec laquelle une protéine se lie à
un échangeur dépend de quoi (2)

Answer 4

1- le pH de la solution
2- la nature et concentration des autres ions

Question 5

Quels sont les deux caractéristiques des échangeurs utilisés en chromatographie?

Answer 5

1- la nature de la matrice

2- Le type de groupement fonctionnel

Question 6

de quoi sont constitués les matrices en chromatographie?

Answer 6

polymères insolubles (résines), souvent formés de polysaccharides (cellulose) et sont très poreux.

Question 7

Quelle est la différence entre échangeur fort et faible?

Answer 7

Un échangeur garde sa charge entre le pH 3-10 et l’échangeur faible est chargé dans une gamme de pH plus restreinte.

Question 7

Que génère le reseau poreux

Answer 7

Beaucoup plus de surface de contact

Question 8

Où se lient les protéines aux échangeurs par force électrostatique?

Answer 8

ENTRE la surface de la protéine et les groupements chargés sur l’échangeur.

Question 9

Qu’est-ce qui contrebalance les charges de l’échangeur?

Answer 9

Les contre-ions

Question 10

Les protéines doivent déplacer les contre-ions pour s’attacher aux échangeurs. Comment se fait-il?

Answer 10

La protéine doit posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions.

Question 11

Comment la colonne est-elle lavée?

Answer 11

Avec une solution tampon.

Question 11

La protéine doit se trouver immobilisée sur l’échangeur d’ion. Quels sont les facteurs qui permettent ceci?

Answer 11

Le pH et la concentration saline.

Question 12

Plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’echangeur est forte…

Answer 12

Plus la migration sera retardée.

Question 13

Qu’est l’élution?

Answer 13

C’est une étape de récupération où les protéines liés à l’échangeur d’ions peuvent être éluées par un tampon salin supérieur au tampon de lavage.

Question 13

Quels sels sont utilisés pour l’élution? Que font-ils

Answer 13

KCl et NaCl. Ils déplacent directement les protéines.

Question 14

Comment les molécules sont-elles séparées lors de la chromatographie par gel-filtration?

Answer 14

Selon la taille

Question 15

Quels sont les trois principes de la chromatographie par gel-filtration?

Answer 15

1- La phase stationnaire consiste en un réseau de polymères possédant des pores.

2- Les pores sont grands mais sélectives

3- Les protéines qui n’entrent pas dans les pores traversent la colonne plus rapidement

Question 16

De quoi sont formés les matrices insolubles de la gel-filtration?

Answer 16

agarose ou polyacrylamide sous forme de bille réticulée

Question 17

La porosité des gels dépend de quoi?

Answer 17

La masse moléculaire du polymère et le nombre le liaisons croisées qui se forment entre les molécules du polymère.

Question 18

La masse des protéines est mesurée en quoi?

Answer 18

kDa

Question 19

Les protéine qui passent à travers la colonne sont élues selon quoi? Qui est éluée en premier?

Answer 19

Selon leur masse moléculaire. Les plus grosses sont éluées en premier.

Question 19

Qu’est le volume d’élution d’une protéine?

Answer 19

Le volume nécessaire pour éluer la protéine après sont dépôt sur la colonne.

Question 20

Que permet le volume d’élution relatif Ve/V0)

Answer 20

D’estimer la masse moléculaire d’une protéine.

Question 21

Décrire la dialyse

Answer 21

Si one protéine est dans une faible concentration et on élimine du sel par dialyse, on peut les précipiter les protéines.

Question 22

Que fait la centrifugation sur colonne-filtre

Answer 22

Ça utilise une membrane poreuse pour séparer les protéines selon leur poids moléculaire. (pense au taq)

Question 23

Que se passe-t-il dans une chromatographie d’affinité?

Answer 23

Un ligand qui lie spécifiquement une protéine est fixé à une matrice poreuse et inerte.

Question 24

quand un solution contenant un mélange de protéines traverse la colonne,
la protéine d’intérêt se liera au ligand immobilisé, alors que les autres protéines ne s’y lieront pas et sortiront de la colonne

Answer 24

:)

Question 25

Que fait-on pour détacher la protéine du ligand?

Answer 25

Une élution

Question 26

L’approche de la chromatographie est favorable pourquoi?

Answer 26

Car elle exploite les propriétés biochimiques (propre à la protéine) au lieu de physico-chimique (pas unique)

Question 27

Que représente la constante de dissociation?

Answer 27

Mesure de l’affinité protéine-ligand

Question 28

Quels sont les contraintes de la matrice de la chromatographie d’affinité (3)

Answer 28

• chimiquement inerte
• poreux
• Nombreux groupes fonctionnels

Question 29

Quel est le polymère le plus fréquemment utilisé pour chromatographie d’affinité?

Answer 29

L’agarose

Question 30

Quels sont les cinq méthodes de détection des protéines lors de l’élution d’une colonne chromatographique

Answer 30

-Absorption des protéines dans l’UV (autour de 280 nm)

• Essai colorimétrique
• Essai enzymatique
• Détection de la protéine sur gel SDS-PAGE
• détection de la protéine avec un anticorps