Klausurvorbereitung Flashcards
1
Q
DNA-Microarray
A
- mehrere Messpositionen (Spots) darauf Fängermoleküle (Sonden, RNA oder DNA))
- immobilisierten Fängermoleküle reagieren spezifisch mit ihren Partnern aus Probe
- Detektion mit Sandwich-Hybridisierung
- Detektionsmolekül (mit Fluoreszenzfarbstoff) bindet ausschließlich an Komplex aus Ziel- und Fängermolekül
- Auswertung photometrisch
- sehr lange, aufwendig
- Genomtypisierung
- SNP-Analyse (Mutationsdetektion)
- med. Diagnostik, differentielle Genexpression, Tumorklassifizierung
2
Q
Denaturierung
A
- eine zum Verlust der biolog. Aktivität führende Veränderung der räumlichen Struktur eines Proteins
- auch physikal./chem. Verhalten geändert
- reversibel (Salzfällung) oder irreversibel
- durch Änderungen von Temperatur, pH-Wert, Zugabe von org. Lösungsmitteln, chem. Agenzien (Schwermetalle)
3
Q
Renaturierung
A
- Übergang eines Proteins oder einer Nukleinsäure vom denaturierten Zustand in die aktive, funktionsfähige Konfiguration
- durch Alkoholfällung/Salzfällung wird Protein Wasser aus Hydrathülle entzogen –> Spaltung der H-Brückenbindung –> Denaturierung
- erneut Wasser hinzugeben –> Renaturierung
4
Q
Hybridisierung
A
- DNA- oder RNA-Einzelstrang dient als Fängermolekül, an welches sich komplementäre DNA- bzw. RNA-Einzelstränge (unter Ausbildung von H-Brückenbindungen zwischen den entsprechenden Basen) anlagern –> bei Biochip/Microarray
5
Q
Plasmidformen, Reihenfolge bei Auftrennung
A
- supercoiled: natürliche Form des Plasmids
- offenkettig: ein Strang der Doppelstrang-DNA gebrochen
- linear: beide Stränge gebrochen
- im Agarosegel: linear (läuft am wenigsten) –> offenkettig –> supercoiled
6
Q
Restriktionsendonukleasen
A
- Hydrolasen
- „schneiden” Plasmide –> spalten sequenzspezifisch an definierten Stellen die kovalente Bindung (Phosphodiesterbindung zwischen Ribose und Phosphat) der DNA
- glatte (blunt) oder klebrige Enden (sticky ends)
- Typ I & II: unspezifische Schnittstellen, ATP-Verbrauch
- Typ II: reproduzierbare Gruppen von vorhersehbaren Fragmenten, kein ATP-Verbrauch
7
Q
Reverse Transkription – reverse Transkriptase
A
- bei Retroviren (RNA-Viren)
- „umschreiben” von mRNA in komplementäre DNA (cDNA) –> Gene erhalten
- kann dann vervielfältigt werden (PCR) –> Klonierung
8
Q
Roth-Nanoquant
A
- beruht auf Grundlage der Bradford-Methode
- Roth Nanoquant Reagenz bindet an basische Aminogruppen der Peptidbindung innerhalb der Proteine –> Reagenz-Protein-Komplex
- Auslösung v. Farbreaktion –> Verschiebung des Absorptionsmaximums von 450nm zu 590nm
- photometrische Bestimmung
- Zunahme der Absorption bei 590nm proportional zur Proteinkonzentration in der Lösung
9
Q
Gelchromatographie
A
- flüssig-chromatographisches Verfahren, mit welchem gelöste Substanzen aufgrund ihrer unterschiedlichen Molekülmasse getrennt werden
- Substanz tritt nicht mit „stationären Phase” in Wechselwirkung
- Trennprinzip beruht auf unterschiedlichem Eindringvermögen der Moleküle in gequollenes Polymer bzw. Gel und der Verweildauer auf der Säule
- Säulenmaterial: granulierte, quellfähige Gele, z.B. Dextran, Agarose oder andere Teilchen eines porösen Feststoffes dienen
- Probelösung auf Säule geben, mit Elutionsmittels (mobile Phase) durch Säule befördern
- durch Diffusion kontrollierter Trennvorgang
- je kleiner Molekül, umso tieferes eindringen in Poren des Trennmaterials desto länger Verweilzeit auf Säule
- Substanzen erscheinen im Eluat in Reihenfolge abnehmender Molekülgröße (große Moleküle zuerst eluiert)
- Bestimmung relativen Zusammensetzung von Gemischen, von Molekülmassen (mittels Referenzsubstanzen bekannter Molmasse) , der Molekülgrößenverteilung
- Ausschlussvolumen: Volumen bis zum 1. Tropfen Substanz
- Elutionsvolumen: erster bis letzter Tropfen Substanz
10
Q
essentielle Aminosäuren
A
- Valin
- Phenylalanin
- Leucin
11
Q
Agarosegelelektrophorese
A
- Probe auf Agarose-Gel auftragen und elektrophoretisch trennen
- Trennung beruht auf unterschiedlicher Migration von DNA-Fragmenten im elek. Feld
- Wanderungsgeschwindigkeit abhängig von:
- Ladungszahl, Größe der Moleküle, Stärke des elek. Feldes
- Ethidiumbromid dazugegeben –> interkaliert in DNA –> unter UV- Licht sichtbar
12
Q
Coulometrie
A
- es wird elek. Ladung (Strommenge) gemessen, die notwendig ist um einen in Lösung befindlichen Stoff vollständig umzusetzen
- Stoffmenge wird über die zum quant. Umsatz erforderliche Ladungsmenge bestimmt
13
Q
Szintillation
A
- Radioaktivität wird gemessen
- β- und γ-Strahlungen werden von org. bzw. anorg. Szintillanten aufgenommen und das Licht dann wieder emittiert
- Anzahl an Photonen pro Zeiteinheit werden mit Szintillationszähler registriert
- Szintillant: z.B. PPO (1-Phenyl-4-phenyloxazol)
14
Q
Reflektometrie
A
- Menge einer absorbierenden Substanz in fester Form wird berechnet
- gut für halbquantitative Teststreifenanalytik
15
Q
Biuret
A
- Cu2+ Ionen bilden mit Peptidbindungen eines Proteins blau-violetten Komplex im alkal. Bereich
- Komplex absorbiert bei 545nm
- Vorteile: Methode erfasst alle Arten von Proteinen, Referenzmethode für Gesamtproteinbestimmung im Plasma/Serum
- Nachteil: Linearbereich zwischen 1-20 g/l (geringe Empfindlichkeit)
16
Q
Bradford
A
- beruht auf Eiweißfehler (Indikator-Methode)
- Proteine können Umschlagspunkt eines Säure-Base-Indikators zu niedrigeren pH-Werten verschieben
- protonierte Aminogruppen des Proteins stabilisieren deprotonierte Form des Indikators
- Indikator (z.B. Coomanie Brilliant Blue) existiert pH-abhängig in versch. Formen –> anionisch (blau), neutral (grün), kationisch (rot-braun)
- Vorteile: einfache Handhabung, 1000fach empfindlicher als Biuret
- Nachteile: vorhandene protonierte AS-Seitenketten Voraussetzung, es werden nicht alle Proteine erfasst
17
Q
Prostatakarzinom: klinischer Indikator
A
- das Prostata-spezifische-Antigen (PSA) (Serinprotease)
- auch bei Prostatahyperplasie
- mit ELISA u. RIA nachgewiesen
18
Q
Schritte der Plasmidisolation/alkal. Lyse
A
- Isolation der Plasmid-DNA durch Zellaufschluss (Lyse) –> „High Pure Plasmid Isolation Kit”
- Lysispuffer –> Pellets resuspensieren
- NaOH/SDS –> Zelle wird vollständig lysiert
- SDS denaturiert Proteine, NaOH die Plasmid-DNA
- Kaliumacetat –> Neutralisierung Renaturierung der Plasmid-DNA
- Isopropanol –> Alkoholfällung
- negativ geladene DNA wird an Bindung-Puffer gebunden
- mehrmals gewaschen (restliche Zellbestandteile entfernen)
- anschließend mit Elutionspuffer gelöst = isoliert
19
Q
3 Beispiele für extrachromosomale DNA
A
- Plasmide = kleine doppelsträngige, ringförmige DNA, autonom replizierbar
- mitochondriale DNA, DNA der Plastiden, Phagen
20
Q
Topoisomerase 1 und 2
A
- Enzyme, die durch vorübergehendes Spalten und Wiederzusammenfügen der DNA-Helix Ausmaß der Superhelixbildung regulieren
21
Q
Topoisomerase I
A
- erzeugt Einzelstrangbrüche der DNA-Doppelhelix, DNA-Stränge können frei rotieren
- keine ATP-Verbrauch
- bei Replikation u. Translation
22
Q
Topoisomerase II
A
- Gyrase bei Bakterien, erzeugt Doppelstrangbruch der DNA-Helix
- ATP-Verbrauch
23
Q
palindromische Struktur
A
- kurze doppelsträngige DNA-Sequenz, die auf beiden Einzelsträngen in einer Richtung (z.B. 5´ 3´)die gleiche Basenabfolge zeigt
- Startsequenz für Typ II-Restriktionsendonukleasen
24
Q
Enzym, das DNA Fragmente verknüpft
A
- Ligase –> verknüpft Bindungen unter gleichzeitiger ATP-Spaltung
- Voraussetzung ist wenigstens eine freie PO43—Gruppe
- bildet Phosphodiesterbindungen zwischen zwei DNA-Fragmenten aus
- ATP-Verbrauch
25
Q
Biochips
A
- mithilfe von biochemischen Prozessen werden nach „Schlüssel-Schloss-Prinzip” Biomoleküle, wie z.B. Nukleinsäuren oder Proteine erkannt und mit elek. Signal nachgewiesen
- mehrere Messpositionen (Spots) –> darauf versch. Fängermoleküle (Sonden)–> Antikörper
- immobilisierten Fängermoleküle reagieren spezifisch mit ihren Partnern aus Probe –> Bindungsreaktion
- Detektionsmolekül bindet ausschließlich an Komplex aus Ziel- und Fängermolekül
- Detektionsmolekül mit Enzym markiert
- m. H. von Enzym wird Substrat zu Produkt umgesetzt –> gebildetes Produkt geht elektrochem. Reaktion ein –> elek. Stromfluss
- = Redoxrecycling
- schnell, kostengünstig
26
Q
Anwendungsgebiete Biochips
A
- Medizinische Diagnostik (Nachweis von Antikörpern, Krankheitserregern)
- Agro- und Umweltanalytik (Überwachung, Steuerung von Fermentationsprozessen)
- Lebensmittelanalytik (z.B. Untersuchung von kontaminiertem Wasser, Schadstoffen in Nahrungsmitteln)
- Industrie, Forschung, Lehre (z.B. Identifizierung/Kontrolle von Schlüsselgenen von MO, Prozesskontrolle bei Protein- und Enzymproduktion)
27
Q
Antibiotika
A
- Gyrasehemmer: z.B. Ciprofloxacin –> hemmen bakterielle Topoisomerase II –> Störung der DNA-Replikation
- Chloramphenicol: bindet an 50S-Untereinheit der Ribosomen –> hemmt Peptidyltransferase bakterieller Ribosomen –> Störung der Ausbildung neuer Peptidbindungen, hemmt Translation
28
Q
Amylase: optimale Bedingungen
A
- optimaler pH-Wert: 6-8
- optimale Temperatur: 37 °C (Körpertemp.)
- Cosubstrat Cl-
- keine inaktivierenden Substanzen (Schwermetalle etc.)
29
Q
Amylasen
A
- Hydrolasen –> katalysieren hydrolytische Spaltungen
- α-Amylase hydrolysiert 1,4-α-glykosidische Bindungen
- zerlegt Amylose und Amylopektin in dem es im Innern der Moleküle angreift (Endoenzym)
- kann α-1,6-glykosidische Bindungen nicht abbauen
- im Speichel und im Pankreas
- β-Amylase fast ausschließlich im Pflanzenreich
- greift Stärkemolekül vom nichtreduzierenden Ende her an (Exoenzym)
- hydrolysiert jede zweite α-1,4-glykosidische Bindung unter Abspaltung von Maltosemolekülen
- kann keine α-1,6-glykosidischen Bindungen spalten
- γ-Amylase spaltet vom Kettenende je 1 Glucoseeinheit ab
- hydrolysiert 1,4 und 1,6-glykosidische-Bindungen
- kann Stärke und Glykogen fast vollständig abbauen
- bei Pilzen
30
Q
lactosefreie Milch, Praktische Bedeutung
A
- Lactose wird mit Lactase hydrolytisch zu Glucose und Galaktose gespalten
- Lactase: in Zellen des Dünndarmepithels gebildet
- manche Menschen haben Lactoseintoleranz (Mangel an Lactase)
- Milchzucker kann nicht abgebaut werden Verdauungsstörungen (Krämpfe, Durchfall)
- Herstellung lactosefreier Lebensmittel
31
Q
Ammoniumsulfatfällung
A
- weißer Niederschlag
- bei vielen Eiweißen wird durch Salzzugabe Löslichkeit erhöht –> Einsalzeffekt
- durch Kompensation der eine Assoziation begünstigenden Dipoleigenschaften des Proteinmoleküls durch hydratisierte Gegenionen zustande
- nach durchschreiten eines Maximums –> weitere Erhöhung der Salzkonzentration führt zu Löslichkeitsverminderung –> Aussalzeffekt
- Konkurrenz der Salzionen und der Proteinmoleküle um Lösungsmittel Wasser
- durch Salzzugabe: Wasseraustritt aus Hydrathülle, Löslichkeit des Proteins sinkt
- gesättigte Lösung!
32
Q
Proteinfällung - Ethanol und Bleiacetat
A
- org. Lösungsmittels (Methanol, Ethanol, Aceton) erniedrigt Dielektrizitätskonstante des Mediums und verstärkt dadurch Anziehungskräfte zwischen den Proteinmolekülen
- Proteinmoleküle aggregieren und von einer bestimmten Lösungsmittelkonzentration an kommt es zur Ausfällung des Eiweißes
- Wasserzugabe erhöht Dielektrizitätskonstante und baut Hydrathülle wieder auf, der Niederschlag löst sich auf
- Schwermetall-Ionen können Disulfid-Brücken in Proteinen aufspalten
- betroffenen Enzyme verlieren irreversibel ihre Funktion (Denaturierung)
- bei Überschuss an Kupfersulfat bilden sich Chelatkomplexe, der Niederschlag löst sich auf
33
Q
Zugabe von Trichloressigsäure oder Sulfosalicylsäure zu Proteinen
A
- Veränderung des pH-Wertes führt zu einer reversiblen Denaturierung und somit zu einer Verringerung deren Löslichkeit –> Proteine fallen aus
- Sulfosalicylsäure stärkere Säure –> stärkeres ausfallen
34
Q
Enzym das Olivenöl spaltet? Woraus wird es gewonnen?
A
- Olivenöl enthält Triglyceride (an Glycerol gebundene Fettsäuren), Ölsäure, Linolsäure etc.
- Lipase (Hydrolase)
- hydrolysiert Esterbindungen zwischen Fettsäuren und Glycerol –> Entstehung freier Fettsäuren, Glycerol, Monoacylglyceride
- Gewinnung aus Pankreassekret von Säugetieren (Pankreaslipase)
