Klausurfragen BC Flashcards
Abfolge der Klonierung
- Isolation und Reinigung der DNA
- Amplifizierung der Ziel-DNA-Sequenz
- Kontrolle der DNA-Amplifizierung
- Restriktion der DNA-Fragmente
- Einbau der geschnittenen Fragmente in Plasmid
- Übertragung des neuen (rekombinanten) Plasmids in Wirtszelle
- Selektion erfolgreich transformierter Klone
Eigenschaften u. Funktionen von Plasmide. Welche Sequenzinfo muss es tragen?
- Aufnahme und Übertragung von fremden Erbeigenschaften –> sind Vektoren für Klonierung, Vermehrung und Expression beliebiger DNA-Fragmente
- ori-Sequenz (origin of replication) benötigt –> befähigt zur autonomen Replikation
alkalische Lyse (Plasmidisolation) erläutern. Welche Reagenzien? (4)
- Isolation der Plasmid-DNA durch Zellaufschluss (Lyse) –> “High Pure Plasmid Isolation Kit”
- Lysispuffer –> Pellets resuspensieren
- NaOH/SDS –> Zelle wird vollständig lysiert
- SDS denaturiert Proteine, NaOH die Plasmid-DNA
- Kaliumacetat –> Neutralisierung –> Renaturierung der Plasmid-DNA
- Isopropanol –> Alkoholfällung
- negativ geladene DNA wird an Bindung-Puffer gebunden
- mehrmals gewaschen (restliche Zellbestandteile entfernen)
- anschließend mit Elutionspuffer gelöst = isoliert
4 Möglichkeiten Bakterienzelle aufzuschließen
- mechanisch: nassmalen, Gefrierdispersion, Ultraschall, Hochdruckhomogenisation
- nicht-mechanisch: chemisch (Laugen, Säuren), biologisch (Enzyme, Einwirkung von Phagen, Autolyse), physikalisch (osmot. Druck)
Ablauf PCR, Komponenten und Schritte
- spezielle Form der DNA-Synthese zur Vervielfältigung eines DNA-Abschnitts
- beide Komplementärschritte werden durch spezielleTaq-DNA-Polymerase bei erhöhter Temperatur und unter Zugabe von 2 Primern (Begrenzung des DNA-Abschnitts) gleichzeitig kopiert
- DNA-Denaturierung mit Bildung von Einzelsträngen
- Primeranlagerung
- DNA-Neusynthese im Thermocycler
Funktionen von Restriktionsenzymen
- sind Hydrolasen
- “schneiden” Plasmide –> spalten sequenzspezifisch an definierten Stellen die kovalente bindung (Phosphodiesterbindung zwischen Ribose und Phosphat) der DNA
- glatte (“blunt”) oder klebrige Enden (“sticky ends”)
- Typ I: unspezifische Schnittstellen, ATP-Verbrauch
- Typ II: reproduzierbare Gruppen von vorhersehbaren Fragmenten, kein ATP-Verbrauch
Klassen von Restriktionsenzymen Unterschiede?
- Typ I bis IV
- Typ I und III ATP-Verbrauch
- Typ I schneidet die DNA an einer zufälligen Stelle weit von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin.
- Typ II schneidet die DNA innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der Erkennungssequenz. Benötigt kein ATP und hat keine Methyltransferase-Aktivität.
- Typ III schneidet die DNA etwa 20 bis 25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin
- Typ IV schneidet nur methylierte/ hydroxymethylierte/ glucosyl-hydroxymethylierte DNA - im Gegensatz zu den Typen I-III, die durch Methylierungsmuster gehemmt werden
Welche AS bindet Roti-Nanoquant-Reagenz? Name des Farbstoffs?
- bindet an basische Aminogruppen der Peptidbindung innerhalb der Proteine –> Reagenz-Protein-Komplex
- Farbstoff Coomassie
- beruht auf Grundlage der Bradford-Methode
- Auslösung der Farbreaktion –> Verschiebung des Absorptionsmaximums von 450 nm zu 590 nm
- photometrische Bestimmung
- Zunahme der Absorption bei 590 nm proportional zur Proteinkonzentration der Lösung
Prinzip der Auftrennung im Agarosegel/Prinzip der elektrischen Auftrennung v. Nukleinsäure
- Trennung beruht auf unterschiedlicher Migration von DNA-Fragmenten im elektrischen Feld
- Wanderungsgeschwindigkeit abhängig von: Ladungszahl, Größe der Moleküle, Stärke des elektrischen Feldes
3 Enzymklassen mit Beispiel
- Transferasen: Hexokinase
- Lyasen: Aldolase
- Oxidoreduktase: Lactat-Dehydrogenase
Ammoniumsulfatfällung
- weißer Niederschlag
- bei vielen Eiweißen wird durch Salzzugabe Löslichkeit erhöht –> Einsalzeffekt
- Kompensation der eine Assoziation begünstigenden Dipoleigenschaften des Proteinmoleküls durch hydratisierte Gegenionen
- nach Durchschreiten eines Maximums führt weitere Erhöhung der Salzkonzentration zur Löslichkeitsverminderung –> Aussalzeffekt
- Konkurrenz der Salzionen und der Proteinmoleküle um Lösungsmittel Wasser
- durch Salzzugabe Wasseraustritt aus Hydrathülle, Löslichkeit des Proteins sinkt
- gesättigte Lösung
Optimale Bedingungen für Speichelamylase
- pH6-8
- 37° C
- Cosubstrat Cl-
- keine inaktivierenden Substanzen (Schwermetalle etc.)
DC fettes Öl mit Pankreaslipase Welche 4 Substanzgruppen ablesbar?
Triglycerid, Mono- und Diglycerid, freie Fettsäuren
2 Kohlenhydratnachweise beschreiben
- Benedict-Reagenz dient wie das Fehling-Reagenz zum Nachweis von reduzierenden Zuckern –> In der Lösung fällt dann ein Niederschlag aus, der je nach Zuckerkonzentration rot, gelb oder grün ist
Quantifizierung von Vitamin C
durch redoximetrische Titration mit 0,05-molarer Iodlösung unter Zusatz von Stärke (Iodometrie)
Prinzip der Gelchromatographie beschreiben und Anwendungsmöglichkeiten
- flüssig-chromatographisches Verfahren
- Auftrennung von Makromolekülen allein nach ihrer Molekülmasse mit Hilfe des gequollenen Netzwerks eines granulierten Gels
- kleinere Moleküle dringen tiefer in Netzwerk und werden länger zurückgehalten
- Trennung von Makromolekülen wie Aminosäuren, Enzyme , Peptide, Polymere und Proteine.
3 essentielle AS und dazugehörige Formeln
- Valin
- Phenylalanin
- Leucin
Def. Denaturierung + Bsp. f. molekularbiologische Methode (2)
- eine zum Verlust der biologischen Aktivität führende Veränderung der räumlichen Struktur eines Proteins oder DNA
- physik./chem. Verhalten verändert
- reversibel od. irreversibel
- durch Änderung der Temp., pH, org. LM, chem. Agenzien
- z.B. Proteinfällung durch Ethanol ODER PCR!!
Enzyme der Replikation erläutern. (Topoisomerase, Primase, Ligase, Helicase) (4)
- Topoisomerasen sind Enzyme, die für Änderungen der Topologie von DNA-Molekülen verantwortlich sind, welche bei einer Superspiralisierung notwendig sind
- Primasen spielen bei der Initiation der Verdopplung des Erbmaterials eine Rolle
- DNA-Ligasen sind Enzyme, die DNA-Stränge verknüpfen
- Helikasen initiieren die Verdopplung der DNA durch das Entwinden der Einzelstränge
Def. Chaperon (1)
Proteine, die neu synthetisierten Proteinen „helfen“, sich korrekt zu falten
Techniken f. Übertragung v. DNA in Zellen. Erläutern. (3)
- Transduktion: Gene werden mit Hilfe von Phagen auf Bakterium übertragen
- Transformation: Aufnahme von Bruchstücken fremder DNA
- Konjugation: durch Plasmabrücke (Pilus) werden genet. Informationen von einem Bakterium zum anderen übertragen
Wie erfolgt Bindung von DNA-Sonden (Fängermolekül) an Oberfläche eines Glasslides (Micro-Array) (3)
- Spotten oder On-Chip-Synthese
Reverse-Transkriptase. Fkt. + Anwendung (2)
- bei Retroviren (RNA-Viren)
- “umschreiben” von mRNA in komplementäre DNA (cDNA) –> Gene erhalten
- kann dann vervielfältigt werden (PCR) –> Klonierung
Def. Markergene (1)
- eindeutig identifizierbare, kurze DNA-Abschnitte, deren Ort im Genom bekannt ist
Def. d. 4 “Omics” (4)
- Genomics : Erforschung des Aufbaus des Genoms und Wechselwirkungen zwischen den Genen
- Transcriptomics : Erfassung der Gesamtheit in einer Zelle hergestellter RNA- Moleküle
- Proteonomics : Erforschung der Gesamtheit der Proteine unter definierten Bedingungen und zu einem definierten Zeitpunkt mit biochemischen Methoden!
- Metabolomics - umfassende Analyse aller Metabolite einer Zelle/ eines Organismus oder Körperflüssigkeiten unter genau definierten Bedingungen.
2 Vorteile d. NMR gegenüber d. GC/MS, bzw. HPLC/MS (2)
- relativ einfachen Probenaufbereitung -> Derivatisierung entfällt da eine Derivatisierung der Proben, wie sie bei GC-MS-Untersuchungen meist erforderlich ist, entfällt. Zum anderen ist durch die Aufnahme eines 1H-NMR-Spektrums die Identifizierung und Quantifizierung von 30 bis 50 verschiedenen Metaboliten möglich. Ein weiterer Vorteil der NMR-Spektroskopie liegt in der Möglichkeit zur direkten Quantifizierung aller Metabolite anhand eines einzigen definiert zugesetzten Standards. Die arbeits- und zeitaufwendige Aufnahme von Kalibrationskurven kann somit entfallen.
Kohlenhydrat-abgeleitetes Vitamin. Strukturformel, quantitative Bestimmung, verbale Erläuterung, Reaktionsgleichung. (5)
- Vitamin C
- iodometrisch
reduzierende Wirkung v. Lactose. Erläutern + Reaktionsgleichung. (2)
- in Lösung offenkettige Glucosereste –> freie Aldehydgruppe wirkt reduzierend
Ionenaustauschchromatographie erläutern. Def. Gegenion u. Ankergruppe. (5)
- Säulenchromatographisches Verfahren zur Trennung von Ionen aufgrund ihrer unterschiedlichen elektrostatischen Bindung an eine geladene, wasserunlösliche Polymermatrix
- Gegenionen: austauschbare (bewegliche) Anionen oder Kationen
- Ankergruppen: fixierte ionisierbare Gruppen (Festionen)
Warum Lipase-Substitution b. Mukoviszidose (2)
- meisten Mukoviszidose-Kranken haben eine Pankreasinsuffizienz. Die damit verbundene unzureichende Fettverwertung führt zusätzlich zum erhöhten Energiebedarf aufgrund verstärkter Atemarbeit oft zu einer Mangelernährung. Eine frühzeitige Lipase-Substitution und eine hochkalorische, fettbetonte Ernährung können die Lebensqualität der Patienten dann bessern.
Was passiert b. Zugabe v. Sulfosalicylsäure, bzw. Trichloressigsäure zu Proteinlösung (Beobachtung, Erläuterung, Unterschiede) (3)
- Veränderung des pH-Wertes führt zu irreversibler Denaturierung -> Verringerung der Löslichkeit -> Proteine fallen aus
- Sulfosalicylsäure stärkere Säure -> stärkeres Ausfallen
Microarray (Grundprinzip). 2 Einsatzgebiete.
- Messpositionen (Spots), darauf Fängermoleküle (Sonden, RNA od. DNA)
- immobilisierte Fängermoleküle reagieren spezifisch mit ihren Partnern aus der Probe
- Detektion mit Syndwich-Hybridisierung
- Detektionsmolekül (mit Fluoreszensfarbstoff) bindet ausschließlich an Komplex aus Ziel- und Fängermolekül
- Auswertung photometrisch
- z.B. bei Genomtypisierung
Prinzip d. Auftrennung v. Proteinen mit 1D-Page.
Denaturierung und Trennung im elektrischen Feld nach Größe und Ladung
2 Produkte, die industriell durch Mikroorganismen hergestellt werden.
Brot, Bier, Wein, Käse
3 Faktoren, die Überexpression rekombinanter Gene beeinflussen.
- Promotor
- Operon
- Transgen
Komponenten d. “Präproinsulin”
Präproinsulin-Molekü mit 110 Aminosäuren, bestehend aus:
- einer Signalsequenz (leader peptide) mit 24 Aminosäuren,
- an die sich die 30 Aminosäuren der B-Kette anschließen,
- danach kommen zwei Aminosäuren und das C-Peptid (connecting peptide) mit 31 Aminosäuren,
- gefolgt von weiteren zwei Aminosäuren und der A-Kette mit 21 Aminosäuren
3 Beispiele für Folgeerkrankungen d. Diabetes.
Retinopathie, diabet. Fuß, Nephropathie
3 charakteristische Symptome f. Diabetes II
Durst, Schwindel, Müdigkeit
Amylasen im menschlichen Organismus. Wo greifen sie im Kohlehydratmolekül an.
- alpha-Amylase in Speichel und Pankreas
- hydrolysiert 1,4-alpha-glykosidische Bindungen
- zerlegt Amylose und Amylopektin im Inneren der Moleküle
Thrombozytopenie, Thrombozytopathie. Ursachen.
- Thrombozytopenie: Mangel an Thrombozyten im Blut, z.B. durch hämatologische Erkrankungen oder Leberzirrhose
- Thrombozytopathie: Funktionsstörung der Thrombozyten, durch Medikamente oder Erbkrankheiten
“sticky-ends”. “blunt-ends”.
glatte und klebrige Enden beim Schneiden von Plasmiden
extrachromosomale Erbträger.
- Plasmide = doppelsträngige, ringförmige DNA, autonom replizierbar
- mitochondriale DNA
- DNA der Plastiden
- Phagen
Denaturierung, Renaturierung, Hybridisierung i. Zusammenhang mit Nukleinsäuren.
- Renaturierung: Übergang eines Proteins/Nukleinsäure vom denaturierten Zustand in die aktive, funktionsfähige Konfiguration
- Hybridisierung: DNA- oder RNA-Einzelstrang dient als Fängermolekül, an welches sich komplementäre DNA- bzw. RNA-Einzelstränge (unter Ausbildung von H-Brücken zw. den einzelnen Basen) anlagern
Überprüfung einer Plasmidisolation auf Agarosegel. Welche Plasmidformen lassen sich beobachten.
- supercoiled: natürliche Form des Plasmids
- offenkettig: ein Strang der Doppelstrang-DNA gebrochen
- linear: beide Stränge gebrochen
- im Agarosegel: linear (läuft am wenigsten) -> offenkettig -> supercoiled
Nachweis Aminosäuren mit Ninhydrin. Reaktion, Formeln Ausgangsprodukte und Endprodukt.
…
2 Bedingungen, die entscheident Aktivität v. Proteinen beeinflussen.
Temp, pH?!
Aus welchen beiden Komponenten ist Stärke aufgebaut. Strukturelle Gemeinsamkeiten und Unterschiede.
- Amylose: lineare Ketten mit helikaler (Schrauben-)Struktur, die nur α-1,4-glykosidisch verknüpft sind und
- Amylopektin: stark verzweigten Strukturen, mit α-1,6-glykosidischen und α-1,4-glykosidischen Verknüpfungen
Bedeutung v. Lactose-freier Milch. Herstellung.
- für Lactose-intolerante Menschen
- Hinzufügen von Lactase zur Vorwegspaltung in Glucose und Galaktose
Ringform und offenkettige Form v. Glucose malen.
…
Lineweaver-Burk-Diagramm. Skizze. 2 wichtigsten Punkte mit Werten.
…
Was sind Okazaki-Fragmente und wo kommen sie vor?
- während der DNA-Replikation entstehenden kurzen Abschnitt des Folgestrangs aus DNA und RNA
11) Bedingungen und Substanzen Fettspaltung
- durch Lipase Angriff an Carbonylkohlenstoffatom des Triglycerids
- Bildung von tetraedischem Zwischenprodukt –> Acyl-Enzym-Komplex
- Lipolyse: Abbau von Triglyceriden
- stufenweise Hydrolyse der Triglyceride durch Lipase
- Angriff an Position 1 und 3 und Freisetzung der Fettsäuren
- Triglycerid -> Diglycerid -> Monoglycerid -> Glycerol
- von Hormonen beeinflusst (Adrenalin fördert, Insulin hemmt)
- Colipase: Komplexbildung mit Lipase
Proteinlösung mit Bleiacetat (Beobachtung und Erklärung)
Graufärbung durch Bildung von PbS
Endprodukt bei Abbau von Ölsäure
Acetyl-CoA
Auflauf Replikation + Komponenten
- Die Initiationsphase, in der die Replikation angestoßen wird: Hier wird die DNA-Doppelhelix an einer bestimmten Stelle mit Hilfe der Helicase aufgebrochen und eine Polymerase lagert sich nach der Markierung durch eine Primase an die aufgebrochene DNA.
- Die Elongationsphase, in der die eigentliche Vervielfältigung vonstattengeht: Die beiden Stränge werden zeitgleich komplementär synthetisiert.
- Die Terminationsphase, in der die Replikation beendet wird
Wozu Antibiotika-Resistenzgen auf Plasmid?
als Markergen
