Katalog Fragen - Teil 4-6 Flashcards
(36 cards)
4.1 Was muss man zu einem in Wasser gelösten DNA Einzelztrang hinzufügen, um einen komplementären Strang zu synthetisieren?
DNA Polymerase,
Primer,
dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphosphate, NICHT NTPs (=rna)),
Puffer
4.2 welche zwei Erfindungen ermöglichen, dass PCR kostengünstig und effektiv in jedem labor eingesetzt werden kann?
1) die temperaturresistente Taq-Polymerase aus dem Bakterium Termophilus aquaticus
2) die Synthese von Oligonukleotiden (Primer!)
4.3. es wurde der ORF von GFP amplifiziert und neben einen Promotor von E. coli in einen Vektor kloniert
Es entsteht aber keine Fluoreszenz in den mit diesem Konstrukt transformierten Bakterien
welche TYPEN von Mutationen können in der PCR passiert sein?
> >
- GFP geschädigt –> Fehler im GFP wegen fehlendem PROOF READING von Tag pol.!!!!! –> (frame shift Mutationen)
über 30000 Zyklen kommen deutliche Fehler auf, zB. Stoppcodon «
- ‘frame shift Mutationen” -> eine Base zu viel eingebaut
- Promotoren können beschädigt sein
4.5 wie würden sie zeigen, dass es sich wirklich um eine Mutation handelt und nicht um ein Problem mit dem Bakterienstamm, den sie zur Expression genutzt haben?
- das Plasmid aus Bakterien wieder extrahieren und sequenziellen!!!
- Negativkontrolle-
- versuch-wiederholen-
4.6 der “Cycle threshhold” ist:
der Zyklus, an dem eine Probe einen bestimmten Punkt in der real-timePCR Reaktion erreicht
( Ct: Punkt, ab dem Fluoreszenz detektierbar - vor Exponent. Wachstum ,denn da können Probleme wie Endprodukthemmung entstehen)
4.7 ein PCR Zyklus besteht aus __ Schritten:
ein PCR Zyklus besteht aus 3 Schritten: Denaturierung, Primer Annealing, Elongation
4.8 wie viele Moleküle entstehen nach vier Zyklen PCR aus einem DNA-Duplex? (ds)
16 doppelsträngige DNA Moleküle
4.9 Ein PCR Primer ist 18 Basen lang, wie häufig wird er ans menschliche Genom binden? (…)
(… Anzahl von malen, die man die Sequenz im Genom hat)
(3.3 x 10^9)/4^18
[ (Genomgröße)/(Base^Primer) ]
Zusatz: Wahrscheinlichkeit, dass man eine Sequenz trifft:
(3.3 x 10^9)/[(1/4)^18]
4.10 ein 22,345 bp langer Teil des Mausgenoms soll mit PCR amplifiziert werden. Sie erstellen Primer, die die Längen 20 bzw. 22 bp und die selbe Schmelztemperatur haben.
Sie erhalten kein Amplifikat. Warum?
a. primer haben nicht die selbe Länge
b. Zielregion ist zu groß
c. Primer zu kurz
d. Maus-DNA kann man nicht amplifizieren
e. sie haben mehr als einen Primer in der Reaktion benutzt
[ein 22,345 bp langer Teil des Mausgenoms soll mit PCR amplifiziert werden. Sie erstellen Primer, die die Längen 20 bzw. 22 bp und die selbe Schmelztemperatur haben.
Sie erhalten kein Amplifikat. Warum? ]
b.: Zielregion ist zu groß. Um 22,345 bp zu amplifizieren
es geht nur bis ca. 10 000 bp!
4.11 Was ist die ideale Temperatur für Taq-Polymerase?
die ideale Temperatur für Taq-Polymerase ist 72˚C Grad Celsius
- 12 Welche dieser Reagenzien sind nicht in einer typischen PCR Reaktion?
a. NTPs
b. MgCl2
c. Ethidiumbromid
d. DNA Primer
e. E. coli DNA Polymerase
Welche dieser Reagenzien sind nicht in einer typischen PCR Reaktion?
a.: NTPs. es sind dNTPs vorhanden, man will desoxy um eine DNA zu erstellen. (NTP = RNA)
c. Ethidiumbromid wird erst beim Auftragen auf ein Gel hinzugefügt
(sonst würde es in der PCR stören ?)
e. es wird nicht die DNA Polymerase von E. coli verwendet sondern die von Termophilus aquaticus
(die aber im e coli drin sein kann wenn sie jemand rein gemacht hat)
- 13 Was erwarten sie, wenn sie in einer PCR die Temperatur in der Annealingphase erhöhen und die Elongationsphase verlängern ?
a. Präzision und Ertrag sind reduziert
b. Präzision und Ertrag sind erhöht
c. Präzision ist reduziert, Ertrag ist erhöht
d. Präzision ist erhöht, Ertrag ist reduziert
Was erwarten sie, wenn sie in einer PCR die Temperatur in der Annealingphase erhöhen und die Elongationsphase verlängern ?
b. Präzision und Ertrag sind erhöht
- 14 was erwarten sie, wenn in einer PCR Primer verwendet werden, die etwas kürzer sind und variable Stellen aufweisen ?
a. PCR Reaktion beginnt nicht
b. PCR Reaktion endet nach dem ersten Zyklus
c. Reaktion produziert ein einziges, kurzes PCR Produkt
d. Reaktion ergibt eine Mixtur unterschiedlicher Produkte
was erwarten sie, wenn in einer PCR Primer verwendet werden, die etwas kürzer sind und variable Stellen aufweisen ?
d. Reaktion ergibt eine Mixtur unterschiedlicher Produkte
da der Primer mit größerer Wahrscheinlichkeit falsch binden kann, kann alles mögliche amplifiziert werden
- Nenne zwei Funktionen der Tag Polymerase.
- Was ist eine TaqMan Probe/Sonde?
Taq-Pol. Funktionen:
a) 5’3’ Elongationsaktivität
b) 5’3’ Exonukleaseaktivität
===TaqMan PROBE! nicht primer! (kann nicht verlängert werden, wird nur v. tag pol überlaufen
> hat einen fl. Reporter die und einen quencher kovalent gebunden (fl5’ Qench3’)
- TaqMan hilft, fortschritt der qRTPCR zu verfolgen.
-wenn quencher NAH an fl wird Energie vom fl über FRET an quencher gegeben = kein leuchten.
- die 5’-3’ exonukleaseaktivität der TaqPol löst erst den Quencher, danach die FL ab - so kann die FL ausgestrahlt werden
- die leg enthält trotzdem Primer, an die die Synthese beginnt - sie kommen bloß irgendwann an die TaqManProbe und verdauen diese weg
Eine TaqMan sonde ist eine Sonde in Form einer probe. Sie hat am 5’ Ende eine Reporter-Dye Markierung und am 3’ Ende einen Quencher. Sind beide gleichzeitig vorhanden, stimmt der Quencher das Signal der reporter dye ab. Wenn der Strang jedoch von TaqPol erreicht wird, (5’-3’), wird die FL.reporterDye wegen der Exonukleaseaktivität abgenommen, sie ist permanent vom Quen. entfernt und kann ein FL Signal emittieren. Dieses wird in der qPCR gemessen.
Also die Wanderung der taqpol über die TaqMan Sonden als Probe trennt R.dye vom Quencher ab und erlaubt ein FL Signal.
4.16 wie sind die Achsen einer qRT PCR beschriftet?
x Achse: number of cycles
y Achse: Fluorescence
- 17
- wie berechnet man den ∆Ct wert?
- wie berechnet man den ∆∆Ct wert?
∆Ct: es müssen 2 Proben vorhanden sein/ 1 Probe und 1 Referenz.
Ct - cycle threshold, festgelegter Punkt ab dem sichere FL delektiert wird. -> Die ANZAHL an Zyklen, an der der Festgelegte Fluoreszenzstärke erreicht wird
[ ∆Ct = Ct1 - Ct2 ]
∆∆Ct: es müssen 4 Proben vorhanden sein=> 2 Proben + jeweils Reference.
die ∆Ct werden wie oben beschrieben berechnet - aus einer Probe und IHRER REF.
Die Differenz der beiden ∆Ct ist ∆∆Ct.
[ ∆∆Ct = ∆Ct1 - ∆Ct2 ]
- nenne 3 Sequenzierungsmethoden.
Welche ist die heute dominante?
Welche anderen Techniken kennen wir?
nenne 3 Sequenzierungsmethoden.
I) Maxam-Gilbert chemical sequencing
(base specific breakage mit modifiziert. Base, 5’FL mark., “sequencing ladder” v unten nach oben im Gel gelesen, jede Base eine Spalte im Gel)
II) Sanger sequencing
( modifizierte Replikations-Reaktion! , base specific Abbruch wegen Einbau ddNTP in wachsende Kette (Konz. dNTP/ddNTP bestimmt Länge des Fragments, von ENZYM Polymerase abhängig, Reaktionsmix enthält 5’ fl markierte PRIMER (-> Pol.)
fragm. werden Bspezif. abgebrochen, “sequencing ladder” v unten nach oben im Gel gelesen, jede Base eine Spalte im Gel; heute alle ddNTP unterschiedlich. fl markiert = alle in 1RG )
III) Pyrosequencing - darunter: Solex/Illumina sequencing , 454 Sequencing, SOLiD seq., Ion torrent, SMRT/nanopore seq.
Welche ist die heute dominante?
->Solex/Illumina sequencing
Welche anderen Techniken kennen wir?
ChIP-Seq. , Microarray, SNP analysis
?? 5.1. Welches dieser Projekte ist am besten für NGS geeignet?
- zu bestimmen, ob ein Tumor eine bestimmte Missense-Mutation aufweist
- das Transkriptom eines Tumors bestimmen
- eine genetische DNA Probe nach einigen bekannten SNPs zu untersuchen
- alle Versuche
?? Welches dieser Projekte ist am besten für NGS geeignet?
- zu bestimmen, ob ein Tumor eine bestimmte Missense-Mutation aufweist — nein, da wäre die Sequenz der Missende mut. ja bekannt, man bräuchte nur zB. microarray. NGS ist für unbekannte Seq.
- das Transkriptom eines Tumors bestimmen — ja, man will sehr große mengen an UNBEkannten Sequenz bestimmen.
- eine genetische DNA Probe nach einigen bekannten SNPs zu untersuchen — nein, auch hier sind die SNPs ja bekannt, man kann andere Methoden anwenden und man will nicht alles sequenziert haben.
(JA) das Transkription eines Tumors bestimmen.
=> (alle zu einem bestimmten Zeitpunkt. transkribierten Gene) - NGS ist geeignet wenn man gesamtes Trasnkriptom untersuchen will - ganz große Mengen ??
5.2. welcher dieser Schritte ist wichtig für die Erstellung eines Template für NGS?
- DNA Isolierung
- zerkleinern der DNA in Fragmente
- überprüfen der Qualität und Quantität der DNA Fragmente
- Alle Schritte
Template für NGS = ein Primer
- Alle Schritte.
Alle Schritte sind wichtig um ein gutes, spezifisch passendes Template zu erstellen. : - DNA Isolierung
- zerkleinern der DNA in Fragmente
- überprüfen der Qualität und Quantität der DNA Fragmente
5.3. Nachdem Sequenzen eines NGS Experimentes erhalten wurden - was tun sie zuerst?
- Validieren der Daten mit einer anderen Methode
- Publizieren der Daten
- Bioinformatische Analyse der Daten
- weitere Analysen einzelner Sequenzen
Nachdem Sequenzen eines NGS Experimentes erhalten wurden - was tun sie zuerst?
X- Validieren der Daten mit einer anderen Methode - nein, wir haben ja noch gar nichts aus den Daten gemacht, wissen nicht ob es richtig falsch/ was es überhaupt ist
X- Publizieren der Daten
(JA)- Bioinformatische Analyse der Daten - wir haben nur die Infos bekommen, jetzt muss man sie digital KARTIEREN/MAPPEN und auswerten etc.
X- weitere Analysen einzelner Sequenzen - wir haben ja noch gar keine Reihenfolge, also weiß man gar nicht was man nochmal analysieren sollte
5.4. Was bedeutet Brückenamplifikation?
— hier geht mehr! Detektion bei Illumina?
Die Amplifikation von DNA Fragmenten, welche durch Anbindung an einer Oberfläche eine Brückenform ausbilden.
Dabei werden DNA Fragmente mit Adaptern versehen, die an spezifische Primer auf einer Oberfläche binden können.
Die nun aufgeschmolzenen Einzelstränge können an die Primer binden und eine Brücke bilden, und Zugabe von dNTPs und Pol. erlauben die Synthese eines dazu komplementären Stranges ab dem Primer.
Nach dem Auftrennen der entstandenen Doppelstränge kann der Vorgang mehrmals wiederholt werden, wobei lokale Cluster entstehen, die viele Amplifikate von nur einem DNA Cluster enthalten.
5.5. wie unterscheiden sich Illumina und 454 Techniken?
Beide Techniken gehören zu den deep sequencing Methoden.
unterschiedliche Miniaturisierung!
454: [Pyrosequenzierung!]. hat eine größere Leselänge von ca. 400-500bp, dauert aber viel länger als Illumina.
Emulsion mit PCR Tröpfchen - Bei 454 befindet sich amplifizierte DNA durch Linker an Kügelchen befestigt, welche in Waben auf einem Glasfaserkabel sitzen. Die Ergebnisse der Sequenzierung werden wie bei der Pyrosequenzierung durch Lichtsignale dank PPi erhalten.
Illumina = [Brückenamplifikation!].
Sequencing by synthesis, markierte Nukleotide mit Fluorophoren
lokale cluster mit DNA Fragment Amplifikat
hat eine viel kürzere Leselänge von 20-300bp, ist dafür aber sehr viel schneller (67gb in 1tag, Mensch. Genom 3.3gb = mehrere Genom am tag lesbar)
5.6. Welches Reaktionsprodukt der Kettenverlängerung wird für die Visualisierung der Pyrosequenzierung genutzt?
Pyrophosphat - energiehaltiges PPi
wird beim Verlängern der Phosphodiesterbr. abgespalten, PPi + APS = ATP, ATP + Luciferase => Luciferin+into Oxyluciferin
5.7. DNA wird aus Mensch. Chromosom extrahiert und 10 Gene vom Chromosom 22 werden amplifiziert. die PCR Produkte werden aufgereinigt und mit Sanger sequenziert. an bestimmten Positionen treten Ambiguitäten auf - warum?
Sanger: Kettenabbruch, 5’FL, auf Gelelektr. Seq.ladder gelesen
weil menschl. genom heterozygot und diploid ist, die genetische Information ist 2 mal vorhanden und kann von Mutter und Vater unterschiedlich sein. SNPs!
