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K F 1 > Katalog Fragen - Teil 1-3 > Flashcards

Katalog Fragen - Teil 1-3 Flashcards

1
Q
  1. Warum spielen Mitochondrien eine Rolle für den Erfolg des Klonierens beim Kerntransfer, aber nicht beim Embryo Splitting?
A

Beim Kerntransfer können beschädigte/defekte Mitochondrien den Organismus beeinträchtigen, beim Embryosplitting bekommen beide Zellen die selben Mitochondrien.
Der Kern und das Mitochondrium müssen zusammen passen. Genom müssen auf einander abgestimmt sein = Kompatibilität. Das Mitochondrium benötigt zur Atmung nämlich Proteine aus dem Kern (u anders herum)

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2
Q
  1. Wie kann man ausschließen, dass Dolly durch eine nicht erkannte Befruchtung entstanden ist?
A

Das Mutterschaf hatte einen deutlich anderen Phänotyp (DNA) - andere Rasse Schaf: Mama = Scottish Blackface, Dolly = Finn Dorset

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3
Q
  1. man erhält weiße Kolonien, aber kein längeres Insert nach Restriktionsverdau. Warum?
A

Man nutzt Lach für blau/weiß detktion. in diesen Genabschnitt wird Insert eingefügt - wenn ja wird es weiß, wenn nichts bleibt es blau (bildet beta-Galactosidase)
Weiße Farbe bedeutet, es wurde ein Insert eingefügt. Blauer Farbstoff = es ist kaputt.
=> Weiß aber “leer”: es ist kein langes Insert drin: zB nur 2 Base. –> Leserahmen für Blau ist verschoben = Gen ist kaputt. das kann auch passieren, obwohl kein Insert drin ist.

NHEJ - non homologous end joining - falls geschnitten wurde und einfach repariert - Schnittstellen defekt - “Nick by restriction enzymes”

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4
Q
  1. Plasmide, die in multi-copy vorliegen, nennt man

oder auch häufig replizierte Plasmide.. oriR oft besucht

A

relaxierte Plasmide. (Gegenteil davon: stringente Plasmide)

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5
Q

(! more info needed !)

1. Welche Art Enzyme braucht man, um mittels Gateway-Technologie zu klonieren?

A
  • keine Restriktionsenzyme
  • klonasen
  • Integrasen
  • Exzisionasen
  • für DNA Schnittstelle: Nukleaseaktivität
  • {Integrase; Exzisionase }- schneiden DNA, ersetzen das andere Plasmidstück ein - nach Vorbild von Phasen Lambda

Phage L kann an attenuationssstellen das Gen einbauen.

Klonasen
Clonase: catalyzes in vitro recombination between an entry clone (attL-flanked “gene”) and an attR-containing destination Vektor

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6
Q 
1. Nenne die Funktion zu diesen Vektorattributen:
Restriktionsstelle
Replikationsursprung
Promotor
Antibiotikaresistenz
A

Restriktionsstelle: erlaubt die Insertion von DNA in den Vektor
Replikationsursprung: (Ori) wird zur Dupikation des Vektors benötigt [Info: Plasmide_UND Bakterien.Chromosom! haben nur 1 ORI! sonst würden sie bei Rep.aneinander stoßen)
Promotor: wird für die Expression des Inserts benötigt
Antibiotikaresistenz: erlaubt Selektion von Bakterien, die den Vektor aufgenommen haben (Transformation)

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7
Q
  1. Welche enzymatische Aktivität brauchen sie für Golden Gate Klonierung?
A
  • Typ II Restriktionsenzyme (BsaI),

- DNA Ligase (fast immer nötig!)

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8
Q

!!! more info needed !!! 1.11 Wie können sie ohne Restriktionsenzyme klonieren?

A

Gibson- Assembly -> ersetzt Restriktionsenzyme Endonuklease (5’-3’) , DNA Ploymerase, DNA Ligase

{aber Ligase ist ganz am ende doch kurz benötigt…?} die letzte Phosphodiesterbindung…..

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9
Q

2.1 was passiert in einer Zelle, wen Cas9 geschnitten hat, aber kein DNA Template für homologe Rekombination mitgeliefert wurde?

A

NHEJ!

die DNA Fragmente werden von Nukleasen verdaut
oder Versuch zur Reparatur: kann aber Fehler rein bringen

  • Doppelstrangbruch ist eine anfällige Stelle für Reparatur mit/ Einsetzen von falschen Nukleotide
    (beim Versuch, Enden wieder zsm. zu setzen sind Ligasen nötig)
  • Nuclease können beginnen, die Stränge zu verdauen
  • NHE: non homologous end joining= klebt einfach Sachen zsm., die kaputt u. in der Nähe sind (falsche Basen eingebaut (Indels), nicht passende Stücke)
    (dann werden Zellen nach Fehlern gescreent (Fehler gewollt) Fehler sind aber die ausnahme )
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10
Q

2.2 wie kann Cas9 in der Gentherapie eingesetzt werden, um Erbkrankheiten wie zb cystische Fibrose zu heilen?

A

es können defekte Gene aus dem Genom heraus geschnitten werden.
CF kann durch Punktmutationen entstehen

  • durch Cas9 können theoretisch gesunde Gene an die Stelle eingesetzt werden, an der sich vorher Kranke Gene befanden und herausgeschnitten wurden
  • ->Gutes Gen reinpacken: Wenn in Zelle ungebundene DNA mit losen Enden herumschwirrt !! (zusätzlichste. Template), baut ein genaueres System (!!! HDR, homology-directed repair) sie nahtlos an der geschnittenen Stelle ein und erzeugt so gezielte Veränderungen im Erbgut = gesundes Gen

+ Lentizellen ??? liefern theoretisch. Therapieteile in Lungenzellen

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11
Q

2.3 welche enzymatische Aktivität hat Cas9?

A

es ist eine Doppelsträngige DNA-Endonuklease

Cas proteine sind Nukleasen (schneiden 2 Stränge der DNA)

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12
Q

2.4 CRISPR repeats finden sich in

A

bakterieller DNA

manche Phagen haben auch CRIAPR-Repeats: Vermeidung von Konkurrenz mit anderen Viren

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13
Q 
2.5  welches der folgenden Proteine wurde nicht für Genomedierung genutzt? 
ZFN
TALENs
CRISPR-Cas9
MHC
A

(zfn = Zink finger nuclease; TALENs = Transcription activator-like effector nuclease)

proteindesign!

Lösung: MHC

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14
Q

2.6 CRISPR Sequenzen im Zielgenom werden erkannt durch:

A

RNA (Guide RNAs)

in CRISPR/Cas9

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15
Q

2.7 Wofür steht die Abkürzung CRISPR

A

clustered regularly interspaced short palindromic repeats

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16
Q

2.8 wie wird die guide RNA für die Genomedierung hergestellt und welche Rolle spielt sie für den Prozess?

A

single guide RNA wird künstlich hergestellt (oligo array Synthese).
in Natur:
eine CrisprRNA (crRNA), die zur Zielsequenz passt, und eine Trans activating crRNA (tracrRNA), die kurz mit crRNA hybridisiert und an Cas9 gebunden ist.

künstlich, einfacher:
Single GuideRNA = sgRNA = crRNA + tracrRNA als 1 Molekül

tracrRNA und guide Sequenz zusammen setzen

crRNA (crispr RNA) + tracrRNA (trans-activating crRNA) = sgRNA (single guide RNA)

(weniger Komponente = weniger Regulation notwendig. Zusammenbau von Komplexen ist kompliziert, simpler ist besser)

17
Q

2.9 wie unterschiedet sich CRISPR-Cas9 fundamental von anderen Genomedierungswerkzeugen?

A

es kann gezielt schneiden
enthält RNA, während andere nur Proteine enthalten !
! man kann leichter eine RNA designen als ein gesamtes Protein (was auch sein Ziel finden und funktionieren muss)

18
Q

2.10 welchen Vorteil haben ANDERE Genomedierungswerkzeuge gegenüber CRISPR-Cas9?

A

RNAis:
regulieren Gene herunter, ohne das ganze Genom zu verändern / das gen zu zerstören - KD, nicht KO

ZinkFingernukleasen Können SPEZIFISCHER sein - die Nuklease kann so lang gemacht werden, wie man will = mehr Basen = mehr Spezifität bei Anlagerung (viele Basen sollen erkannt werden = spezifischer (ZF kann 30 erkennen? CRISPR nur 20???))

19
Q

2.11 Cas9 muss in seiner Sequenz verändert werden, um es zur Editierung von eukaryotischen Genomen zu verwenden. warum ?

A

die Guide RNA (sgRNA) muss an den Zielorganismus/Gen angepasst werden

–> DNA ist in Prok. einfach frei, Transkription-Translation und Genom im selben Kompartiment -

bei Euk. im ZELLKERN -> wie kommen die Proteine zum schneiden in den ZK? !!
NLS anbringen: Nuclear localisation signal = kleiner Teil der Sequenz, der POLAR GELADEN ist == Signal zum IMPORT {man muss in Cas9 Vektoren positiven Fleck einbauen }

20
Q

2.12 wie können Phagen der CRISPR-Abwehr entkommen? nenne 2 Alternativen.

A
  1. Punktmutationen an der Schneidesequenz - Mutation in Protospacerregion = PAM
  2. sie können sich in die CRISPR-Cas Gene integrieren –> in die Cas9 Gene/Locus!!!
    bzw. schnell genug integrieren, um CRISPR zu entkommen
  3. mit Anti Crispr Proteinen (Acr), die den CRISPR Komplex hemmen. Aber: gewisse Konzentration an Acr notw., dazu Kollaboration von Viren notw.
21
Q

?unbeantwortet?? 2.13 CRISPR-Cas Loci sind auch in Phagengenomen gefunden worden. Welche Vorteile könnten Phagen davon haben?

A

???

?(manche Phagen haben auch CRIAPR-Repeats: Vermeidung von Konkurrenz mit anderen Viren)?

22
Q

!!!! 1.12 !!!! nennen sie ein wichtiges Problem des Gibson-clonings.

A

auch im Gibson Cloning sind Ligasen notwendig, ansonsten können Probleme beim Zusammenbau auftreten ? -
nachdem im Gibson MM die Fragmente ein wenig am 5’ Ende verdaut wurden und sich an einander anlagern konnten, wird der rest der Stränge verlängert - aber die letzte Phosphodiesterbrücke muss von Ligasen geschlossen werden?

23
Q

???? 3.1 Wie kann man nachweisen, dass dsRNA Moleküle zu RNA Interferenz führen?

A
  • über Fluoreszenzen Farbstoff:
  • 2 Ansätze anlegen: einer mit Einzelstrg. und einer Doppelstrg.
  • -> nur ds zeigt Wirkung (Pflanzen können das auch)

?????

24
Q

3.2 Wie wird RNAi in Arabidopsis oder C. Elegans verstärkt ?

A

durch RNA-abhängige RNA-Polymerase RdRP
(als Primer gesehen — nicht als fremd gesehen)

–> also den eigenen Primer der RNA nutzen (?) die RNA Pol von der genutzten RNA(i)

25
Q
  1. 3 welches dieser Enzyme spielt KEINE essentielle Rolle bei der RNAi?
    a. Endonuklease
    b. Dicer
    c. Argonaute
    d. Topoisomerase
    e. RNA abhängige RNA Polymerase
    f. RNA Polymerase II
A

Enzym spielt keine Rolle bei RNAi:
d. Topoisomerase
Helikasen reichen aus

weitere Infos:
Dicer und Argonauts sind beide Endonukleasen

26
Q

3.4 in einer Northern- Hybridisierung mit einer Ribosonde erhalten sie zu viele unspezifische Banden - Kreuzhybridisierungen. Wie kann man diese vermindern?

A

Stringenzfaktoren: Stringenz erhöhen (“Grad der Exaktheit” - bei Hybridisierung: Reaktionsbedingungen so eingestellt, dass NUR extrem gut passende (komplementäre ) Molekül. hybridisieren )

erhöhen durch höhere Temperaturen (Schmelztemperatur/GC Gehalt berücksichtigen),
Parameter:
Temperatur,
Salzgehalt und Formamidgehalt der Hybridisierungslösung

-Hohe Stringenz:
hohe Temperatur
niedrige Salzkonzentration (Ionenstärke - Hydrathülle)
hohe Konzentration denaturierter Agentien

27
Q

??!??!?!! 3.5 Welches Resultat einer Endpunkt-RT-PCR
zur validierung eines shRNA (small hairpin RNA, silencing) Ansatzes
zeigt, dass das Experiment nicht geeignet für silencing Experimente ist? (welche Ergebnisse bei…)

Zellen transfiziert mit shRNA gegen die Ziel-mRNA:

WT Zelllinie:

Zellen transfiziert mit “Vektor-shRNA”:

Zellen nur behandelt mit “Transfektionsreagenz”:

A
  • Amplikon sieht man nur wenn RNAi NICHT funktioniert hat (WT sollte ein Amplikon zeigen, weil dort keine RNAi ist)

Zellen transifiziert mit einer shRNA gegen die Ziel-mRNA :
zeigen kein Amplikon.

Wildtyp Zelllinie:
zeigt ein Amplikon

Zellen transfiziert mit ‘Vektor-shRNA’:
zeigen ein Amplikon (shRNA gegen den Vektor?)

Zellen nur behandelt mit ‘Transfektionsreagenz’:
zeigen Amplikon

28
Q

3.6 RNAi kann für funktionelle Genomik genutzt werden. dies wurde besonders erfolgreich für C. elegans eingesetzt. Warum?

A

weil sie durch E. coli Fütterungsstamm die shRNA leicht aufnehmen können

weil die RNA-Abh. RNA-Polymerase die RNAi selbst verstärken kann, sodass die Wirkung größer ist
- die siRNA wird nicht als fremd angesehen, sondern sogar als Primer!

29
Q

3.7 Warum sollte man, um ein unbekanntes ! Gen mittels reverser Genetik zu untersuchen, lieber RNAi statt Transposon-Mutagenese nutzen?

A

Transposon-Mutagenese: ein Transposon soll ins Gen in der DNA rein springen = knock out
-muss sehr oft wiederholt werden, bis transposon das richtige Ziel TRIFFT –> transposons springen auch BELIEBIG OFT rum, sind UNspezifisch!

RNAi: gezielt, kann designed/ zurechtgeschnitten werden (aus dem genom selbst) ,
Vorteil RNAi bei ESSENTIELLEN Genen: Gen wird nicht komplett kaputt gemacht !! , nur runterreguliert = Reduktion der RNA menge (org. STIRBT sonst sofort) -> es geht um ein Unbekanntes gen! vielleicht lebensnotwendig.

[HYPOMORPHE MUTATION: man reduziert nur die Menge d. Transkript/Genfunktion)

30
Q

3.8 HOMOzygote Mausmutanten von Dicer sterben bereits als Embryo, obwohl kein Virenbefall und somit auch keine shRNA-Abwehr nötig war. Warum?

A

(homozygote mutante = also alle dicer gene kaputt)

Dicer produziert kleine Regulator-RNAs, die microRNAs (doppelsträngig).
Somit kann nicht reguliert werden - Genregulation kaputt!

31
Q

1_0)

Welche Arten und Varianten von Klonieren gibt es?

A

ARTIFIZIELLE KLONIERUNG:

reproduktives Klonieren: Herstellung eines gesamten Tieres aus einer Zelle - genetisch identischen Organismus durch asexuelle Reproduktion

therapeutisches Klonieren: Erstellen von Genetisch identischem Gewebe von einem Donor , nicht Erstellung v ganzem Organismus

genklonierung: Klonieren von individuellen Genen o. Genfragmenten

NATÜRLICHE KLONIERUNG:
asexuelle Reproduktion, zB bei Pflanzen (apomixis)
Klonieren von Einzellern durch Isolation
Zwillinge

32
Q

2_12) wie können off-target Effekte in crispr minimiert werden?

A

durch kürzere Expressionszeiten (es binden nur die Teile, die wirklich am besten passen )

verkürzte sgRNA: kürzere Sequenz => weniger mismatches werden toleriert

veränderte Nukleasen: zB Das mit nur einer Schere: so muss die Zielsequenz zwei mal erkannt werden, um wirklich geschnitten zu werden. ansonsten bei einem Schnitt: Reparatur nach Vorlage des gesunden Stranges

33
Q

extra )
bei welcher Wellenlänge absorbieren:

DNA
RNA
Proteine?

wie wird Schmelztemp Bezeichnet (Buchstaben)

A

DNA: 260 nm optimal
RNA: 260 nm optimal
Proteine: 280 nm

Schmelztemp. = Tm

K F 1 (3 decks)

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