INMUNOHISTOQUIMICA teoria Flashcards
¿Cual es la finalidad de la inmunohistoquimica?
Identificar proteinas especificas en tejidos ,ayuda en el dx patologico y decidir TTO
¿Cual es el procedimiento que se usa para sacar las muestras de las proteinas?
1.Partimos cortes histologicos con parafina
2.Desparafinizacion a 60º con XILOL
3.Rehidratacion con etanol en grados decrecientes
100 %,95% ,90% y 85% completando con agua destilada
4.Bloqueo de la peroxidasa del tejido con : Incubacion con H2O2 al 3% disuelto en agua destilada por 10 minutos
5.Eliminar H2O2 : Lavar tejido con Buffer TRIS
6.Recuperacion de antigenos enmascarados ,durante la fijacion de formol
7.Primera Incubacion de cortes histologicos con los anticuerpos primarios de tipo monoclonal por 30 minutos y queda ligado a los tejidos que tienen el antigeno correspondiente
8.Eliminar los anticuerpos no unidos con buffer TRIS
9.Segunda incubacion con anticuerpo secundario que tiene marca de biotina por 15 minutos que se une a l porcion Fc del anticuerpos primarios que quedaron fijos en la Primera incubacion (El anticuerpo primario actua como antigeno para el anticuerpo secundario por lo q se une a su fraccion Fc)
10.Lavado para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos .Incubación con la enzima peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina por 15 minutos. La estreptavidina se unirá a la biotina de los anticuerpos secundarios
11.Lavar con el buffer TRIS
12.Añadir añadir el sustrato cromogénico (Diaminobencidina, DAB) en una solución que contiene peróxido de hidrógeno
13.- Si la reacción es positiva se depositará un material granular de color marrón en el citoplasma de las células epiteliales del tejido :Proteina esta presente corte histologico
14.CONTRA-TINCIÓN CON HEMATOXILINA para colorear los núcleos
15.- Deshidratar y proceder al montaje de la muestra LISTA LAMINA
¿Que fijadores son los que afectan la antigenicidad en un grado menor?
Contienen alcohol o acetona
¿Que fijadores afectan la antigenicidad mas que el formol?
Glutaraldehido
Tetroxido de osmio
¿En que otro paso puede disminuir la antigenicidad de las proteinas?
Cuando incluimos parafina con alta temperatura en los tejidos
¿Cuales son los 2 metodos para la recuperacion antigenica ?
Digestion enzimatica
Calor
¿Como se realiza el metodo de calor?
- Incubacion del tejido en microondas x 30 min con Buffer citrato
- Usamos buffer TRIS para quitar buffer citrato
¿Que tipo de anticuerpos existen ?
Policlonales y Monoclonales
¿Que son los anticuerpos primarios policlonales?
Mezcla de anticuerpos de diferentes especificidades sintetizados por clones de celulas plasmaticas en el conejo
Tienen desventajas
¿Que son los anticuerpos primarios monoclonales?
Se fabrican por técnica del hibridoma que es ilimitada
Alta especificidad
Reduce reacciones cruzadas
¿Para que sirven los anticuerpos ?
Para ver si están presentes o ausentes los antigenos en el corte histologico
Si estan ausentes resultado de la inmunohistoquimica seria negativo
¿Por q en cada paso debe haber lavados con buffer TRIS?
Para eliminar todas las moleculas q no se han unido al tejido
¿Que es la estreptavidina?
proteína tetramérica no glicosilada producida por el microorganismo Streptomyces avidinii, tiene afinidad por la biotina (B7)
¿Cual es la funcion de la peroxidasa de rabano picante?
Reduce H202 en agua y O2
¿Que es un cromogeno?
Sustancia q da color como la Diaminobencidina DAB
