II- 7 Mesure d'une activité enzymatique, applications

Question 1

Généralités

Answer 1

• pas de mesure directe d’une enzyme :mesure de l’activité catalytique
• enzyme = catalyseur saturable
• enzyme allostérique = non michaelienne
• Mesure Vmax → meilleure sensibilité + linéarité + résultats homogènes si [S] >10 Km (→ Vi = 91% Km dans ces conditions)
• Kcat connue uniquement si étalonnée avec enzyme purifiée → utilisable pour les calculs
• isoenzyme : Km et Kcat différents > mesure del’activité globale
• Expression du résultat dépend de la nature du substrat, choisi spécifique de l’enzyme
  → exactitude : choisir le substrat de vitesse la plus élevée avec produit facilement mesurable
• Effet pH : dépend d l’enzyme et du type de réaction (besoin H+) → tamponner à pH optimal (en général proche de la neutralité)
• capacité tampon, suffisante, ørécation de complexation ou d’inhibition, ø impureté
• pharmacocinétique ionisation dépend de la force ionique du milieu (réaction différente à pH constante mais avec variation de concentration OU à concentration constante pH variable)
• tampon activateur : piège le produit formé → déplacement vers la droite
• ↑ la vitesse de réaction jusqu’à 40°C puis dénaturation ↪ T° optimale ≈ vitesse constante

Question 2

Précautions lors d’un dosage enzymatique

Answer 2

• standardisations méthodes → comparaison possible des résultats
• respect T° : facteur le plu sinfluençant : + 10°C → vitesse x2 → tamponnée 0,05°C
• sérum + ensemble des réactifs puis ajout du substrat spécifique
• ne pas mesurer la vitesse de la phase d latence → démarrer dès le début de la zone linéaire
• utiliser un blanc réactif
• si vitesse trop rapide : [S] n’est plus saturante → diluer l’enzyme

Contrôle qualité par sérums dosés (pas d’étalonnage à partir des mesures d’activités enzymatiques du sérum)

Question 3

Méthodes de dosage enzymatique

Answer 3

• toutes les méthodes cinétiques puisque mesure d’une vitesse

→ En 2 points

• discontinue → cinétique en un temps fixé : Vmax = équilibre
• arrêt de l réaction en 1 temps donné + mesure de S ou de P dans le milieu réactionnel
• trop d’étapes → trop d’erreurs
• utiliser uniquement quand impossible de mesurer directement

→ Cinétique

• continue = direte → calcul de la pente de vitesse
• mesure par spectrométrie absorption UV/visible
• S absorbé : mesure absorbance ↓
• P absorbe : mesure absorbance ↑
• S+P absorbent : utiliser ε différentiel
• pas de mesure continue : intervalle de 1-15 secondaes
• spectrofluométrie : sensibilité * 100
• turbidimètre : mesure ↓ absorbance (par ↓ degré de turbidité d’une suspension)
• néphélémétrie :: mesure lumière diffusée à 90°C par rapport à la lumière incidente
• conductimétrie : seulement si P ionisé mais pas S
• potentiométrie : si la réaction libère des H+ (ou titrage continu par la soude)
• polarogaphie : dosage substrat des oxydases (glucose, cholestérol)

→ Utilisation de NAD+

• NADH2 absorbe à 340nm/ émet à 460 nm
• considérer la réaction comme à 2 substrats (oxydoréductases +++)
  
  • concnetration saturante
  • NADH2 absorbe à 340 nm mais pas NAD+ → ε différentiel élevé
  • NADH peu autooxydable en absence d’enzyme + bonne conservation
• utilisé dans les réactions consécutives (ø propriétés spectrales de S et P) +++
• à C° > enzyme : réaction à saturation limitante : NAD+ ou NADH2 formé proportionnellement à [S] consommé