Genteknologi og genetisk variasjon Flashcards
Beskriv hvordan du ved hjelp av PCR etterfulgt av DNAVsekvensering kan påvise slike mutasjoner hos pasienter.
Hovedprinsippene ved PCR: DNA denatureres ved oppvarming, spesifikke primere hybridiserer til de 2 DNA-trådene, og en polymerase syntetiserer nye DNA-tråder ved å inkorporere dNTP. Disse tre trinnene foregår ved forskjellige temperaturer. Ved at denne prosessen gjentas mange ganger (ca. 30 ganger), kan DNA amplifiseres. Hovedprinsippene ved DNA-sekvensering: Det forventes at studentene beskriver hovedtrinnene i Sanger dideoxy-metoden og at de gjør rede for manuell og/eller automatisk DNA;sekvenering: Trenger enkelttrådig DNA (templat), primer, dNTP, ddNTP, DNA polymerase og Buffer. Reaksjonen settes opp i 4 rør med henholdsvis ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP (eller i et rør hvis man benytter fire ddNTP merket med 4 ulike fluorescerende forbindelser). Forlengelsen av den nysyntetiserte DNA; tråden stopper når en ddNTP inkorporeres. Produktene fra de 4 reaksjonene separeres og påvises (f eks ved gelelektroforese og merkede ddNTP). Ved å lese av signalene kan DNA;sekvensen i den nylagde DNA-tråden bestemmes. Enkelte studenter kan gi en mer detaljert beskrivelse, men dette er ikke påkrevet.
Forklar prinsippene for Northern blotting analyse.
Northern blotting er et RNA blott, der man ønsker å studere ekspresjon av et gen, evt. se på transkriptenes lengde. Foregår ved å isolere RNA fra celler, separere RNA-molekyler etter størrelse ved geleelektroforese, overføre (blotte) RNA fra gelen til en membran som binder RNA, tilsette en enkelttrådig DNA eller RNA probe (merket med ikke radioaktiv eller radioaktiv markør) fra det genet man studerer. Siden proben vil binde de RNA som er komplementære, vil fremkalling av filmen (for eksempel med autoradiografi på røntgenfilm) gi informasjon (vha. grad av sverting av film og plassering av bånd) om transkriptets mengde og størrelse.
I familier med sporadisk eller familiært paragangliom i hode og hals er det påvist mutasjoner i gener kalt SDHB, SDHC, og SDHD. Disse genene koder for forskjellige subenheter av enzymkomplekset succinat dehydrogenase (SDH). Bruk eksempelet i ledeteksten til å forklare begrepet genetisk heterogenitet.
Ved genetisk heterogenitet kan en fenotype være et resultat av forskjellig genotype: F eks to personer med samme fenotype kan ha mutasjoner i forskjellige gener eller de kan ha forskjellige mutasjoner i samme gen (allelisk heterogenitet). Noen studenter vil kanskje i tillegg beskrive genetisk variasjon, polymorfismer, og dermed diskutere enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP) og strukturelle variasjoner i genomet. Dette er ikke nødvendig for en fullgod besvarelse.
Beskriv prinsippene for Northern blotting og mikromatriseanalyser.
The northern blot is a technique used in molecular biology research to study gene expression by detection of RNA (or isolated mRNA) in a sample. Northern blotting involves the use of electrophoresis to separate RNA samples by size, and detection with a hybridization probe complementary to part of or the entire target sequence. The term ‘northern blot’ actually refers specifically to the capillary transfer of RNA from the electrophoresis gel to the blotting membrane, however the entire process is commonly referred to as northern blotting. A DNA microarray is a multiplex technology used in molecular biology and in medicine. It consists of an arrayed series of thousands of microscopic spots of DNA oligonucleotides, called features, containing picomoles (10-12 moles) of a spesific sequence, known as probes (or reporters). This can be a short section of a gene or other DNA element that are used to hybridize a cDNA or cRNA sample (called target) under high stringency conditions. Probe target hybridization is usually detected and quantified by detection of fluorophore-, silver-, or chemiluminescence-labeled targets to determine relative abundance of nucleic acid sequences in the target. In standard microarrays, the probes are attached via surface engineering to a solid surface by a covalent bond to a chemical matrix. Ikke nødvendig å ta med i svaret på denne oppgaven: The solid surface can be glass or a silicon chip, in which case they are commonly known as gene chip or colloquially Affy chip when an Affymetrix chip is used. Other microarray platforms use microscopic beads, instead of the large solid support. DNA arrays are different from other types of microarray only in that they either measure DNA or use DNA as part of its detection system.
Gjør rede for prinsippene for DNAVsekvensering.
Det forventes at studentene beskriver hovedtrinnene i DNA;sekvensering ved Sanger dideoxy; metoden: Trenger enkelttrådig DNA (templat), primer, dNTP, ddNTP, DNA polymerase og Buffer. Reaksjonen settes opp i 4 rør med henholdsvis ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP (eller i et rør hvis man benytter fire ddNTP merket med 4 ulike fluorescerende forbindelser). Forlengelsen av den nysyntetiserte DNA-tråden stopper når en ddNTP inkorporeres. Produktene fra de 4 reaksjonene separeres og påvises (f eks ved gelelektroforese og merkede ddNTP). Ved å lese av signalene kan DNA-sekvensen i den nylagde DNA-tråden bestemmes.
