genoma eucarioti e procarioti Flashcards
Modello del replicone
Jacob e brenner, cercarono di spiegare gli eventi che portano alla replicazione
e proposero il modello derl replicone, ovvero il DNA sintetizzato partiva da una unica origine
esistono zone di replicazione specifiche del DNA da cui parte la replicazione chiamata replicatore
esistono proteine in grado di legare tali sequenze e iniziare la replicazione chiamate iniziatori
ci deve essere coordinazione tra ciclo cellulare e divisione cellulare
escherichia coli, avendo una unica origine di replicazione, h aun cromosoma che è anche l’unico replicone.
il dna eucariotico possiede più repliconi
Gli EFFETTORI
DnaA che lega ATP e DNA
DnaB cheè una elicasi che lega ATP e DNAC
La DnaC che lega ATp e DNab
i monomeri di dna A formano un complesso attorno al quale si arrotola il DNA
Dna B forma dei complessi esamerici con le proteine accessorie di DNA C
nella regione di denaturazione intervengono altre proteine come HU e IHF
dopo l’assemblaggio della dna primasi DnaG sull’N terminale di DnaB, DnaC viene rilasciato tramte l’idrolisi di ATP e questo permette alla DNA polimerasi terza procariotica di cominciare a sintetizzare i filamenti figli.
Sintesi di DNA
l’esamero di DnaB (l’elicasi) è mantenuta inattiva da DNaC (caricatore dell’elicasi).
Quando DnaC è rilasciata per legare DnaG (primasi) le interazioni proteina proteina fanno reclutare le alre proteine della forcella replicativa.
IL PRIMOSOMA è FATTO DA 3 proteine DnaG che si associano a ciascuna elicasi DnaB per formare il primosoma. Le primasi posizionano primer di 3 nucleotidi in sequenze come ad esempio in E.coli CTG. la sintesi di primer e la liberazione del pirofosfato nell’aggiunta del primo legame fosfodiesterico ad opera dellla DnaG fa si che la reazione di sintesi di primer si airreversibile.
la presenza adesso di primers ovvero di inneschi di 10-12 nt carica la DNA polimerasi III oloenzima che posiziona le SLIDING CLAMP sul primer cominciando ad allungare la catena di deossinucleotidi.
la replicazione avviene sempre in direzione 5’—>3’ la polimerasi I batterica catalizza 20 cicli di polimerizzazione e ha una attività di esonucleasi 3’—>5’.
la polimerasi I è chiamata anche replicasi in quanto è responsabile dell’allungamento della catena (non la pol III) e può riparare i danni al DNA.
nella reazione di allungamento un deossinucleotide, subisce un attacco nucleofilo da parte del gruppo oh del primer sul fosfato in alfa il che libera pirofosfato che, viene degradato dalla pirofosfatasi e questo rende la reazione irreversibile.
l’aggiunta dei nucleotidi avviene in direzione opposta a quello del fila,ento stampo
il deltaG complessivo dell areazione è circa pari a quello dell’idrolisi di una molecola di ATP.
La crescita deve avvenire in direzione 5’—->3’ perchè se il nucleotide venisse aggiunto sul fosfato al 5’, in seguito alla escissione di un probabile nucleotide errato, non verrebbe spezzato nessun legame fosfodiesterico e il nuovo nucleotide corretto non si potrebb elegare.
DNA polimerasi batteriche
i procarioti hanno 5 diverse DNA polimerasi
la DNA pol 1 rimuove i frammenti di okazaki ha attività esonucleasica in direzione 5’—>3’ e anche in direzione 3’—>5’ e ha una bassa velocità di polimerizzazione
la DNA pol 2 è richiamata da danni sul DNA è necessaria alla riparazione degli errori (error-prone), ha attività polimerasica 3’—>5’
la Dna polimerasi 3 è l’enzima principale ha attività polimerasica 5’—>3’ è attiva sa nella sinytesi del filamento guida sia in quella del filamento lento.
è fatta da due nuclei fatti a loro volta da varie subunità che sono la alfa epsilon e teta e i due nuclei sono uniti da una subunità tau (felssibile). I complessi gamma o pinza che permette l’incremento del processo duplicativo è costituito invece da subunità chi e psi.
la polimerasi 4 è coinvolta in sistemi di riparazione come anche la polimerasi 5
la Dna polimerasi 3 ha una alta processività grazie a una minore probabilità di distacco dal dna grazie all’interazione tra la pol 3 e la sliding clamp
la polimerasi 3 procariotica presenta un aforma a palmo di mano e sono presenti 3 domini cioè il palmo il pollice e le dita. Il palmo contiene il sito catalitico ed è quindi asociato al neo-DNA mentre lo stampo è piegato in modo da non farlo passare tra pollice e dita.
le dita trattengono il deossinucleotide trifosfato nella posizione per la reazione e provaocano anche una distorsione dello stampo in modo da esporre nel sito attivo solo la prima base dopo l’innesco. dopo la fromazione del legame fosfodiesterico le dita si aprono e consentono lo spostamento del complesso innesco- stampo di una coppia di basi.
Il pollice ha la funzione di stabilizzare il complesso fra DNA polimerasi e substrato aumentando il numero di nucleotidi nella reazione.
I residui carichi delle dita, spingono i dNTP, permettendo l’interazione con gli ioni metallici nella reazione.
Nel core della polimerasi è presente una selettività cinetica infatt sebbene si possano porre anche ribonucleotidi questi saranno incorporati con un afrequenza minore rispetto ai deossinucleotidi.
Questo è assicurato poichè il sito attivo della Dna polimerasi non è abbastanza grande da contenere il 2’-OH del ribosio.
Se tuttavia viene mutato un amminoacido in un amminoacido più piccolo, questa selettività viene drasticamente ridotta.
La dna polimerasi riconosce la geometria di appaiamento delle basi e questo gli permette di apporre le basi alla giusta distanza affinchè avvenga l’attacco nucleofilo sul fosfato in alfa
nei sisti attivi delle dna polimeras sono presenti ioni magnesio e zinco in grado di deprotonare l’oH sulla catena nascente e favorendo l’attaco nucleofilo.
Proofreading e nicktranslation
lampolimerasi I ha anche attività di proofreading ovvero di correzione di bozze sia in avanti che indietro. Se malgrado tutti i sistemi per evitare appaiamenti errati, se ne verifica 1 viene ridott ala velociytà di sintesi e l’affinità per il 3’-OH in crescita e aument al’affinità per il dominio esonucleasico eliminando il nucleotide errato e ripristinando l’affinità iniziale per i siti catalitici
tramitre un taglio proteolitico può essere divisa in due frammenti, il frammento maggiore che è dotato di attività polimerasica è chiamato frammento di Klenow, che è utilizzato nel sequenziamento (ad esempio nel metodo di Gillert
mentre il frammento più piccolo presenta attività esonucleasica e può dare inizio alla replicazione partendo da una incisione a singolo filamento sul DNA Questo processo è chiamato Nick translation e permette di aggiungere nuovi nucleotidi ( ad esempio radioattivi) sostituend quelli a valle che vengono eliminati
Modelli replicativi
la replicazione avviene in modo discontinuo su un filamento mentre avviene in modo continuo sull’altro filamento .
la sintesi sul filamento lento avviene mediante il posizionamento da parte della dna primasi di numerosi primers ad rna, con la successiva sintesi di frammenti di okazaki.
oltre alle proteine già citate per la replicazione sono necessarie altre proteine come ad esempio La girasi che è in grado di eliminare i superavvolgimenti ed è una topoisomerasi di tipo 2 .
sono necessarie poi e ssb proteins che legano i singoli filamenti ed evitano la loro rinaturazione.
dopodichè la DNA ligasi sigilla le interruzioni lasciate dai frammenti di okazaki
OriC
I REPLICATORI
La replicazione in E. coli (4,2 Mbp) ad esempio avviene su un asequenza specifica chiamata OriC fatta da 245 nt che è ricca di Adenina e timina e presenta 4 ripetizioni da 9 paia di basi e 3 ripetizioni da 13 paia di basi
la replicazione in escherichia coli dura circa 20 minuti.
la sequenza con 3 ripetizioni da 13 bp è ricca in GATC. In presenza di ATP le DnaA, si legano sulla sequenza con 4 ripetizioni da 9 bp e in modo cooperativo denaturano localmente la sequenza da 13 bp permettendo l’entrata dell’elicasi replcativa che è fatto da un esamero di DnaB.
in presenza di DnaC i due complessi esamerici di DnaB vengono caricati sulla bolla di denaturazione definendo cosi le due forcelle replicative biirezionali.
emimetilazione
la coordinazione con il ciclo cellulare nei procarioti fa si che ad ogni ciclo il DNA si replichi soltanto 1 volta, infatti lòa replicazione del sito GATC metilato porta alla formazione di 2 molecole di DNA figlie emimetilate. è stato dimostrato che in escherichia coli, solamente le origini completamente metilate possono dare origine a molecole di DNA figlie, finchè non è ristabilita la completa metilazione, la replicazione non può avvenire. Si pensa che la DnaA abbia un ruolo importante in questa regolazione.
OriC viene metilato da un enzima chiamato Dam metilasi, in grado di metilare l’N6 dell’adenina nella palindrome GATC
Negli eucarioti agiscono le metilasi DAM
Ter e Tus
per quanto riguarda ala terminazione, negli eucarioti questa avviene in corrispondenza di particolari sequenze chiamate sequenze Ter che sono sequenze di circa 2o Bp e l’interazione con le proteine Tus arresta la forcella replicativa in una sola direzione. queste sequenze si trovano a 180 gradi rispetto all’oriC e sono fiancheggiate da 6 sequenze identiche (non palindrome) cioè siti ter
la terminazione della replicazione varia a aseconda della linearità o circolarità della molecola di DNA. se sono circolari dopo la replicazione, rimangono ancorati e quindi devono essere separati tramite una topoisomerasi di tipo 2
solitamente però le origini di replicazione dei procarioti si trovano legat alla membrana tramite una sequenza MAR e quindi la separazione avviene in concomitanza con la citodieresi.
Fabbriche di replicazione nel nucleo eucariotico
Nel genoma umano ad esempio ci sono circa 30.000 origini di replicazione che sono attivate 1 volta a ciclo cellulare. Nella fase G1 si prepara l’attivazione delle origini di replicazione. Gli esperimenti di huberman e riggs dimostrarono l’esistenza di più origini di replicazione e dimostro che le forcellle si muovevano bidirezionalmente, marcando il DNA con timidina triziata.
L’attivazione delle sequenze di replicazione avviene in modo asincrono, ci sono più repliconi.
Negli eucarioti le origini di replicazione possono essere tardive o precoci oppure ci sono origine non utilizzate in tutti i cicli di replicazione
Struttura ARS e controllo della replicazione
Il lievito h aun genoma di 13,5 Mpb suddiviso il 16 cromosomi lineari ognuno contenenet le sue origini di replicazione
ognuna delle sequenze ARS è di 11pb contine almeno una sequenza ACS cioè di consenso alle ARS che è fiancheggiata da regioni ricche in A-T. mutazioni in queste ACS aboliscono la funzione di ARS.
Il legame dele proteine ad ACS porta alla formazione del replisoma. Tuttavia nel lievito non tutte le origini sono impiegate ma sono controllate dal ciclo cellulare.
ARS 1 ade esempio è una origine precoce sul cromosoma 4 vicino al centromero, ma diventa tardiva nel momento in cui viene posta vicino ad ARS501 che si trova sul telomero del cromosoma 5.
Nei vertebrarti invece svolge un ruolo molto importante, l’organizzazioen della cromatina insieme ai nucleosomi.
Complesso pre-RC e di pre-inizio
affinchè un sito sia utilizzato come origine, queto deve essere totalmente metilato
la selezione del replicatore avviene solo grazie alla formazione del complesso pre-RC che è formato da 4 proteine separate che si assemblano su ciascun replicatore.
la prima molecola a legarsi è la ORC cioè il complesso di riconoscimento dell’origine che si lega in corrispondenza di origini ricche in A-T e hanno superavvolgimenti negativi.
ARS contengono 4 regioni (A,B1,B2 e B3) che legano il complesso ORC. ORC si lega in A e B! dopodichè una proteina ABF1 si lega alla regione B3 e questo permette la denaturazione locale del DNA.
poi intervengono Cdt1 e Cdc6 che sono i posizonatori della elicasi, ed infine l’elicasi Mcm7
il complesso pre-RC è poi attivato mediante fosforilazione dovute a Cdk nella fase S. la formazione di nuovi complessi bloccata mediante fosforilazione.
ovviamente prima di tutto ciò devono essere rimossi gli istoni.
per passare poi al complesso post RC, vengono reclutate le polimerasi delta ed epsilon su enrambe le forche, poi la polimerasi alfa che è una primasi ed infine su entrambi i filamenti viene reclutata la pinza beta (PCNA) insieme al caricatore della pinza che si chiama RF-C .
pol delta sintetizza iul lagging
pol epsilon il leading
La polimerasi alfa è una primasi che manca dell’attività di proofreading
la polimerasi delta ed epsilon invece agiscono con alta processività, e hanno attività di proofreading
l’elicasi eucariotica mcm 7 si chiude tramite due altre proteine cioè Cdc45 e GIns e ATP
per impedire il riappaiamento dei filamenti intervengono delle proteine che legano il single strand ovvero le RPA.
la polimerasi alfa sintetizza un primer di 10 nt poi è sostituita
la PCNA ha una forma a ciambella che circonda il DNA neosintetizzato.
La rimozione dei primer negli eucarioti avviene grazie alla endonucleasi FEN1 e una RNasiH e i nick vengono chiusi tramite una ligasi 1
Inibitori della replicazione come antivirali e chemioterapici
le telomerasi possono essere bersaglio dei chemioterapici
Struttura di telomeri e telomerasi
Al termine della replicazione sul filamento lagging viene posto un iltimo primer ad Rna il quale però venendo rimosso da Fen1 o RnasiH, non permette la sua riparazione poichè la Dna polimerasi con contiene la estremità 3’. ecco perhcè nelle cellule staminali l telomerasi utilizza uno stampo ad RNA per estendere il telomero
la telomerasi è costituita da una proteina chiamata TERT che è una trascrittasi inversa, una molecola di RNA stampo chiamata TERC e delle proteine aggiuntive chiamate EST.
l’estremità 3’ del DNA telomerico si appaia con TERC che ha uan sequenza complementare sporgente , questo pi viene ricopiato dalla polimerasi e questo proceso avviene più volte in modo da assicurare
nel lievito le telomerasi sono sempre attive nell’uomo sono presenti a livello delle cellule germinali.
In realtà non è il macchinario replicativo a muoversi ma è il DNA che viene spint dentro poichè il macchinario replicativo è ancorato alla matrice nucleare.
ECCO perchè si parla di FOCI di replicazione
Per quanto riguarda i nucleosomi, dopo la replicazione devono essere ricostituiti i nucleosomi.
Allora intervengono i complessi di rimodellamento della cromatina che idrolizzano ATP prima che intervenga l’elicasi.
nella replicazione, metà dei cromosomi devono essere neosintetizzati e ciò avviene inc he modo:
gli istoni H£ e H4 rimangon ancorati a uno dei due filamenti di neosintesi mentre i dimeri di H2A e H2B sono rilasciati e si mischiano a quelli di neosintesi.
h3-H4 permettono di trasmettere lo stato di condensazione della cromatina. sui cromosomi fratelli vi è la stesssa distribuzione delle modificaioni parentali
Esistono poi proteine con carica negativa che possono distaccare il dna dal nucleosoma usando uno scahperone NAP1 per H2A-H2B e CAF 1 per H£-H4 che ridistribuiscono i nucleosomi
DNA polimerasi III oloenzima
è formata da numerose subunità organizzate in 3 complessi: il complesso gamma fatto da 3 subunità gamma 3 subunità tao 1 subunità delta 1 subunità delta primo 1 psi e una chi
e questa subunità svolge il ruolo di caricare il complesso beta detto anche sliding clamp formato da due subunità beta
il complesso catalitico invece è fatto da una subunità alfa polimerasica, epsilon esonucleasica e teta che stimola l’esonucleasi
le subunità tao flessibili rendono possibile la dimerizzazione di due siti catalitici
il complesso gamma lavora come una morsa per i frammenti di okazaki e aiuta l’anello beta a legare il dna.
il complesso beta è una pinza che lega il DNA
quindi la polimerasi 3 oloenzima presenta due polimerasi core unite da due subunità tau che legano il complesso gamma posizionatore della sliding clamp e la sliding clamp stessa.
poichè la subunità tau è flessibile i core possono agire in modo indipendente.
l’aumentatata velocità è favorita dall’ingreso di molecole di acqua nella sliding clamp
la sliding clamp rimane attaccata al DNA durante la sintesi di frammenti di okazai e richiamare le proteine di riparo.
Nel modello a trombone, il filamento veloce è subito copiato mentre il filamento lento è amntenuto in stand by e ad intervalli regolari viene sintetizzato un innesco insieme ai frammenti.
il caricatore della pinza carica la sliding clamp sul nuovo primer e inizia la sintesi di DNA.
il caricatore della pinza è fatto da 3 subunità tau, delta’ e delta e appartiene alla classe delle AAA+ atpasi. Quando lega l’ATP è un complesso aperto, quando lega l’ADP si hiude. Le 3 subunità tau legano 3 molecole di ATP
Differenza fra DNA polimerasi procariotiche e polimerasi eucariotica
negli eucarioti la sliding clamp è formata da un TRIMERO di molecole di PCNA
negli eucarioti si deve seguire il ciclo cellulare, cioè il DNA deve replicarsi solo 1 volta ogni ciclo
