genetisk diagnostik Flashcards
Varför är det viktigt med genetisk diagnostik?
Interindividuell variation i arvsmassan kan bidra till hur stor risk en patient har för att utveckla en sjukdom, hur hen svarar på ett läkemedel eller hur ett sjukdomsförlopp kommer se ut.
Vart används kunskapen kring genetisk diagnostik mest idag?
Cancer. Det finns ärftliga predisponitioner som kan öka risken för att utveckla olika cancertyper. Kunskapen har bl.a. gett oss “the hallmarks of cancer”
Vilken är muationen som orsakar KML?
KML orsakas av en transformation av hematopoetiska stamceller som uppkommer till följd av en translokation mellan ABL och BCR generna t(9;22). Denna translokation leder till den s.k. philadelphiakromosomen som kodar för ett konstant aktivt tyrosinkinase.
Hur kan translokationen t(9;22) uppkomma?
Vid mitos, då dna molekyler har duplicerats ska cellen dela sig i två dotterceller.
Inför delningen lägger sig kromosomerna i vad som kallas för metafas position. I denna position kan dna korsa över varandra och gener kan byta plats med varandra.
Vid denna translokation blir kromosom 22(ABL) väldigt liten och kromosm 9 (BCR) blir längre då delar av ABL-genen hamnar bakom BCR genen.
Vilken blir konsekvensen av philadelphiakromosomen?
Philadelphiakromosomen är en fusionsgen och kommer ge upphov till ett fusionsprotein som är ett ständigt aktivt tyrosinkinase.
ABL är ett kinas som leder intracellulära signaler för proliferation. När denna gen kombineras med BCR blir ABL genen konstant aktiv vilket ger en ökad proliferation av hematopoetiska celler.
På vilka sätt kan man visualisera ABL/BCR mutationen?
Man kan stoppa cellerna i mitos och titta på kromosomernas utseende i en karyotypering.
Med PCR kan man designa en primer för ABL-genen och en för BC-genen. Får man en pcr-produkt kan man fastställa fusionen och att generna sitter på samma kromosom.
Man kan också, som en kontroll, amplifiera ABL och BCR och sedan titta på längden av fragmenten på en elektrofores. Finns translokationen bör vissa fragment vara korta och andra längre.
Dessa analyser är viktigt för at veta om man ex. kan administrera specifika tyrosinkinasnhibitorer.
Hur används qPCR idag vid KML?
För att kvantifiera mängden muterade DNA-molekyler för att bl.a. kunna monitorera behandling och förlopp.
Beskriv digital PCR (ddPCR).
Om man exempel letar efter en muterad gen i ett patientprov med qPCR kommer gener amplifieras och fluorescerane prober binder till mutation och wt i bulk.
Om mutationen finns men inte i så högt antal kan wt fluorescencen konkurrera ut muterat fluorescens och det missas.
Med ddPCR reduceras denna risk kraftigt genom att man delar upp dna molekylerna i 20 000 droppar om 20ul i varje.
I vissa droppar finns DNA och i vissa inte och i de droppar som innehåller dna sker en enskild pcr reaktion. Man använder fluorescense som detektion och sedan beräkna i hur många droppar en positiv reaktion fanns och detta kan korreleras till hur mycket positivt dna vi hade från början då dna:t distrubueras slumpmässigt i dropparna.
Vilka är fördelarna med ddPCR?
Mindre risk för att missa positiva rekationen i wt fluorescensen.
Man behöver ingen standardkurva eller interna kontroller.
Vilka kan vara applikationerna för ddPCR?
- kvantifiera gener kopplade till en viss cancertyp.
- Abslut kvantifiering av virus.
- Kvantifiering av nukleinsyror
- Titta på enskilda cellers dna.
Beskriv Array-analyser. Ge exempel på hur det används.
Idag har vi kunskap om hela arvsmassan. Detta gör att vi kan sätta in sökgener för alla mänskliga gener på en array och ge dem x och y positioner.
När man sedan vill analysera ett prov hälls det över sökgenerna och man kan se på vilka lokalisationer hybridisering sker.
Ett användningsområde för detta är diagnostik av olika typer av leukemier. Olika tumörceller vid olika leukemier överuttrycker och underuttrycker specifika gener. Av erfaranhet kan man då associera dessa uttryck till specifika leukemier och sedan kunna sätta in adekvat behandling.
Man kan också använda Array för att:
- Hitta SNP:s associerade till sjukdomar
- CNVs = flera kopior av samma gen.
Beskriv sangersekvensering
Man analyserar här en gen i taget. Metoden baseras på att dideoxynukleotider inkluderas i pcr reaktionen och inkorporeras slumpmässigt och stoppar sekvenseringen.
Resultatet blir olika långa fragment beroende på när en dideoxynukleotid bundit in. Man kan se vilken nukleotid som inkorporerats vid stoppet. Från kortast till längst fragment kan man då sekvensera genen mha en elektrofores.
Med sanger sekvensering kan man exempelvis undersöka P53 mutationer.
Beskriv P53.
P53 är ett viktigt protein vid cancer och är det mest muterade vid cancersjukdomar. P53 är en transkriptionsfaktor som kan stoppa G1 och inducera apoptos.
Aktivt P53 aktiverar även proteinet MDM2 som sedan degraderar P53 i en feedback loop. Detta innebär att friska celler har mycket lågt P53 medan muterade celler får högt P53.
De flesta mutationer i P53 ligger i dna-binding site vilket innebär att proteinet inte kan fungera som en transkriptionsfaktor och kontroll av cellcykeln förloras.
Vad kan mutationer i promotorer ger för effekt?
Mutationer i promotorer kan påverka hur stort uttryck vi får av generna som ligger bakom promotorn då transkriptionen börjar vid dessa.
Beskriv vad polymorfismer i promotorn för MDM2 kan få för effekt.
Polymorfismer i promotorn för MDM2 är vanligt. wt i denna gen är TT så polymorfismer kan ge TG eller GG. GG ger ett stort uttryck av MDM2 och detta ger i sin tur lågt P53.
Ca12% av befolkningen har denna variation och skulle de få leukemi skulle prognosen vara mycket dålig då P53 funktionen är nedsatt.
Det arbetas på ett läkemedel som ska kunna bryta interaktionen mellan MDM2 och P53 och på så vid kunna stärka P53 funktionen hos dessa individer - förutsatt att P53 inte redan är muterat för då spelar det ingen roll.
