FL 3 Flashcards
Analytisk storleksseparation & antikroppsbaserade metoder
Vilken är den vanligaste metoden för storleksseparation?
Gelelektrofores.
Vilka format finns på elektrofores?
- Tubgeler är den första designen men används nästan aldrig längre.
- Vertikala geler används oftast vid separation av proteiner.
- Horisontella geler används oftast för DNA och 2D-separation av proteiner. Denna metod är enklare än vertikala geler.
- Kapillärer (tunna kapillärer med gel i).
Hur går gelelektrofores till?
Provet tillsätts i en ände av en gel med porer (ex. agarose eller polyakrylamid). Över delen läggs ett elektriskt fält. Små molekyler vandrar snabbast.
Hur kan man använda fluorescens för att detektera DNA?
En fluorofor (etidiumbromid) interkalerar mellan baserna i DNA. Detta innebär att den lägger sig mellan baserna och binder in till DNA. Detta leder till att etidiumbromid blir starkt fluorescerande pga påverkan från närliggande, kemisk miljö.
Vilken slags gel brukar man använda för proteiner?
Vertikala geler. Använder oftast inte fluorescens.
Vad är isoelektrisk fokusering (IEF)?
Metoden separerar proteiner baserat på deras pI. Gelen har en pH-gradient och går från sur till basisk. Oftast horisontella geler. Måste kyla pga värme genereras. Om vi har ph-gradient och tillsätter proteiner och slår på elektriskt fält så kommer proteinerna vandra till området där de är neutrala.
Vad är 2D-gelektrofores?
En kombination av IEF och SDS-PAGE. Proteiner med samma storlek men olika pI (och tvärtom) kan separeras. I den första dimensionen kör man vanligtvis IEF i stavromad gel. Delen inkuberas i buffert med SDS. Andra dimensionen, SDS-PAGE körs genom att placera IEF-gelen i ena änden av polyakrylamid.
Hur kan man kombinera 2D-gelelektrofores med MS?
Genom att skära ut olika spottar från 2D-gelen och köra masspektrometri kan man identifiera massan i vardera punkt i syfte att få en bild över vilka proteiner som fanns i cellen eller vävnaden.
Vad är kapillärelektrofores?
Det använder en princip som är identisk för plana geler. Skillnaden är att gelen befinner sig i en tunn kapillär som man har laddning över. Prov finns i bägare (anod), sugs upp i kapillär och hamnar i annan bägare (katod). På kapillär finns detektor som mäter ex. Abs280. När proteinerna passerar får man en peak för absorbans, kromatogram skapas.
Vad är skillnaderna mellan klassisk och kapillärelektrofores?
Klassisk är tidskrävande, labintensiv, semi-kvantitativ och parallelliserad. Kapillär är snabb, automatiserad, har hög upplösning, är något svårare att parallellisera, dyrare & mer komplicerad utrustning, har on-line detektiv och små provvolymer.
Vad är den största fördelen med kapillärelektrofores?
Att man kan ha mycket mindre provvolymer än vid vanlig. Särskilt bra om man har dyrbara och små mängder av provet då det förstörs av elektrofores.
Vad kan man använda SEC till?
Till att detektera potentiell aggregering (och se multimerer). För exakt storlekskvantifiering krävs dock standards med känd storlek.
Hur kan analytisk HPLC utföras?
Man hydrolyserar sitt prov, oftast med syra. Provet bryts ned till fria aminosyror och HPLC körs. Från standards vet man när varje aminosyra elueras och kan då kvantifiera mängden av aminosyrorna i provet. Syftet är att ta reda på total proteinkonc. Först bestämmer man konc. av varje aminosyra och då måste man veta sekvensen. Man kan räkna tillbaka och se om det stämmer.
Varför används antikroppsbaserade metoder?
För att de är väldigt specifika, har hög affinitet till skillnad från vanlig spektroskopi. Plus att antikroppar är relativt enkla att ta fram.
Vad kan antikroppsbaserade metoder användas till?
Till detektion och målsökning, även i komplexa prov.
Vad är antikroppar?
En klass av proteiner som binder specifikt till andra molekyler (antigener).
Hur produceras antikroppar i däggdjur?
De genereras av immunsystemet som svar på främmande substanser/patogener (immunogener) och inhiberar och/eller aktiverar andra delar i immunsystemet.