FL 3 Flashcards

Analytisk storleksseparation & antikroppsbaserade metoder

1
Q

Vilken är den vanligaste metoden för storleksseparation?

A

Gelelektrofores.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Vilka format finns på elektrofores?

A
  • Tubgeler är den första designen men används nästan aldrig längre.
  • Vertikala geler används oftast vid separation av proteiner.
  • Horisontella geler används oftast för DNA och 2D-separation av proteiner. Denna metod är enklare än vertikala geler.
  • Kapillärer (tunna kapillärer med gel i).
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Hur går gelelektrofores till?

A

Provet tillsätts i en ände av en gel med porer (ex. agarose eller polyakrylamid). Över delen läggs ett elektriskt fält. Små molekyler vandrar snabbast.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Hur kan man använda fluorescens för att detektera DNA?

A

En fluorofor (etidiumbromid) interkalerar mellan baserna i DNA. Detta innebär att den lägger sig mellan baserna och binder in till DNA. Detta leder till att etidiumbromid blir starkt fluorescerande pga påverkan från närliggande, kemisk miljö.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Vilken slags gel brukar man använda för proteiner?

A

Vertikala geler. Använder oftast inte fluorescens.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Vad är isoelektrisk fokusering (IEF)?

A

Metoden separerar proteiner baserat på deras pI. Gelen har en pH-gradient och går från sur till basisk. Oftast horisontella geler. Måste kyla pga värme genereras. Om vi har ph-gradient och tillsätter proteiner och slår på elektriskt fält så kommer proteinerna vandra till området där de är neutrala.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Vad är 2D-gelektrofores?

A

En kombination av IEF och SDS-PAGE. Proteiner med samma storlek men olika pI (och tvärtom) kan separeras. I den första dimensionen kör man vanligtvis IEF i stavromad gel. Delen inkuberas i buffert med SDS. Andra dimensionen, SDS-PAGE körs genom att placera IEF-gelen i ena änden av polyakrylamid.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Hur kan man kombinera 2D-gelelektrofores med MS?

A

Genom att skära ut olika spottar från 2D-gelen och köra masspektrometri kan man identifiera massan i vardera punkt i syfte att få en bild över vilka proteiner som fanns i cellen eller vävnaden.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Vad är kapillärelektrofores?

A

Det använder en princip som är identisk för plana geler. Skillnaden är att gelen befinner sig i en tunn kapillär som man har laddning över. Prov finns i bägare (anod), sugs upp i kapillär och hamnar i annan bägare (katod). På kapillär finns detektor som mäter ex. Abs280. När proteinerna passerar får man en peak för absorbans, kromatogram skapas.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Vad är skillnaderna mellan klassisk och kapillärelektrofores?

A

Klassisk är tidskrävande, labintensiv, semi-kvantitativ och parallelliserad. Kapillär är snabb, automatiserad, har hög upplösning, är något svårare att parallellisera, dyrare & mer komplicerad utrustning, har on-line detektiv och små provvolymer.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Vad är den största fördelen med kapillärelektrofores?

A

Att man kan ha mycket mindre provvolymer än vid vanlig. Särskilt bra om man har dyrbara och små mängder av provet då det förstörs av elektrofores.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Vad kan man använda SEC till?

A

Till att detektera potentiell aggregering (och se multimerer). För exakt storlekskvantifiering krävs dock standards med känd storlek.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Hur kan analytisk HPLC utföras?

A

Man hydrolyserar sitt prov, oftast med syra. Provet bryts ned till fria aminosyror och HPLC körs. Från standards vet man när varje aminosyra elueras och kan då kvantifiera mängden av aminosyrorna i provet. Syftet är att ta reda på total proteinkonc. Först bestämmer man konc. av varje aminosyra och då måste man veta sekvensen. Man kan räkna tillbaka och se om det stämmer.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Varför används antikroppsbaserade metoder?

A

För att de är väldigt specifika, har hög affinitet till skillnad från vanlig spektroskopi. Plus att antikroppar är relativt enkla att ta fram.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Vad kan antikroppsbaserade metoder användas till?

A

Till detektion och målsökning, även i komplexa prov.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Vad är antikroppar?

A

En klass av proteiner som binder specifikt till andra molekyler (antigener).

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Hur produceras antikroppar i däggdjur?

A

De genereras av immunsystemet som svar på främmande substanser/patogener (immunogener) och inhiberar och/eller aktiverar andra delar i immunsystemet.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

Vilka klasser av antikroppar finns?

A

IgG, IgM, IgA, IgE & IgD

19
Q

Vilken klass av antikroppar används främst i immunokemi/teknik och terapi?

A

IgG då denna oftast ger gensvar vid immunocering.

20
Q

Hur ser en antikropp ut?

A

Den har fyra polypeptidkedjor varav två tunga och två lätta. De hålls samman av disulfidbryggor och det finns även posttranslationella modifieringsställen.

21
Q

Vad är Fc-regionen?

A

Den har flera bindningsställen för receptorer i immunsystemet, vilket medierar immunsvar. Denna region har även bindning till staphylococcal protein A (SpA). Staphylococcus använder protein A i syfte att dölja sig för immunsvaret.

22
Q

Vad är Fab-regionen?

A

Den har C- och V-domäner. Regionen som binder antigener sitter i ändan av den variabla domänen.

23
Q

Vad är en bivalent molekyl?

A

Ex. IgG har två Fab-regioner och är då en bivalent molekyl.

24
Q

Vad är complementarity-determining regions (CDR)?

A

Det är sekvensvariationen i tre hypervariabla regionen som främst bildar site för antigenbindning.

25
Q

Vad är en paratop?

A

Den del på antikroppen som binder antigenet.

26
Q

Vad är en epitop?

A

Den del på antigener där antikroppen binder in.

27
Q

Hur får man fram polyklonala antikroppar (pAbs)?

A

Ex. om man har insulin och vill ha antikropp så injicerar man humant insulin i en mus ex. Detta kallas immunisering. Det kickar igång musens immunsvar och antikroppar mot insulinet produceras. Man tappar sedan blod från musen och kan utifrån det rena fram antikropparna.

28
Q

Hur tar man fram monoklonala antikroppar?

A

Man kan injicera humant insulin i musen och sen ta ut antikroppsproducerande B-celler (dödliga). Fusera dessa med cancerceller (odödliga) så att antikroppar kan odlas i labb. Fusionen kallas hybridoma och är odödliga celler. Screenar efter hybridomas som matchar antikroppen. När den rätta hittas odlar man just den cellen i labbmiljö.

29
Q

Vad är en linjär epitop?

A

Den består av en kontinuerlig (oveckad) sträcka aminosyror av primärsekvensen.

30
Q

Vad är en strukturell/diskontinuerlig epitop?

A

De består av avlägsna aminosyror (i primärsekvensen) vilka förs samman i rymden vid veckning av proteinet.

31
Q

Varför är det viktigt att veta om en epitop är linjär eller strukturell?

A

Om metoden innebär detektering av denaturerat protein så är det bättre att antikroppen känner igen en linjär epitop som är oveckad. Om den känner igen strukturell kan den inte binda om proteinet denaturerats då det blir oveckat. Det slutar alltså binda och har tappat sin funktion.

32
Q

Vilka skillnader finns mellan pAbs och mAbs?

A

pAbs är relativt billigt/enkelt att generera, mAbs är mer komplicerat & dyrt. pAbs är
mix av olika antikroppar, mAbs är en klon. pAbs binder ofta till olika epitoper, mAbs till en. pAbs ej helt förnybar, det är mAbs. pAbs är ofta mer tolerant map förändringar hos antigen, det är inte mAbs.

33
Q

Vad är den största fördelen med mAbs?

A

Att det är en förnybar källa tack vare hybridomas.

34
Q

Hur skapas rekombinanta antikroppar?

A

De skapas in vitro via riktad evolution, immunisering behövs ej. Kan använda ex. fag-displat och ha liknande immunsystem i provrör, får fram bindare (ex. affibodies).

35
Q

Vad är riktad evolution?

A

Man har B-celler i kroppen som vardera producerar en typ av antikropp. Om vi får ex. ett virus finns det stor sannolikhet att någon B-cell har antikropp mot detta virus. Denna B-cell börjar proliferera och skicka ut sådana antikroppar. Man har ett DNA-bibliotek av olika varianter, samling med gener som kodar för ex. affibodies. De är muterade så att varje gen har lite annorlunda sekvens, annars har de samma struktur. Man brukar göra miljarder olika varianter. När man sedan producerar proteinvarianter och sätter ned en insulinmolekyl i röret så fiskar man ut de varianter som binder in. Det finns en sannolikhet att någon kommer kunna binda då storleken på biblioteket är så stort. Bindaren tas ut, produceras, analyseras, nya mutationer sker och processen körs igen. Till slut har man en molekyl som kan användas för ex. in vivo studier.

36
Q

Vad kan man göra åt det faktum att IgG är så stor och komplex?

A

Man kan ta mindre fragment av antikroppen om vi endast vill åt antigenbindande funktionen. Fc-delen kan skalas bort ex.

37
Q

Vad är reportergrupper? Varför används de?

A

Antikroppar kan märkas med olika reportergrupper/molekyler för att ge detekterbar signal. Reportrar kan vara enzym där man sedan tillsätter substrat och låter enzymet omvandla substratet till en kromogen produkt som kan detekteras ex. med absorbans. Det kan även vara en fluorofor där man får fluorescens vid inbindning.

38
Q

Vad är direktinmärkning?

A

Direktinmärkning innebär att reportergruppen konjugeras kovalent till vissa aminosyror på proteinet. Oftast till lysiner med amin-reaktiv kemi eller till cysteiner med tiol-reaktiv kemi. Man tar reportergruppen som är kopplad till kemin och låter den reagera kovalent.

39
Q

Nackdelar med direktinmärkning?

A
  • Vet ej hur många som binder in.
  • Har man märkt in med ex. fluorofor kan molekylen ej användas i radioaktiv kemi.
  • Om ex. lysin sitter i CDR ger det dålig inbindning.
  • Cysteiner bildar disulfidbryggor och reduceringsmedel kan behöva tillsättas, molekylen kan destabiliseras.
40
Q

Vad är indirekt inmärkning?

A

Indirekt inmärkning innebär att reportergrupperna binder icke-kovalent till antikroppen via sekundär-reagens. Ex. species-specifika antikroppar eller biotin/streptavidin. Ofta tar man fram en annan antikropp som binder till antikroppen man använder. Denna märks med fluorofor. Man behandlar först provet med den primära antikroppen, sedan med den sekundära, då kan man mäta fluorescensen.

41
Q

Vilka nackdelar/fördelar finns med indirekt inmärkning?

A
  • Fler steg som kan gå fel.
  • Sekundär antikropp kan kladda ospecifikt på målmolekylen, ge signal.
  • Tar längre tid.
  • Inte lika stark bindning.
    Fördel:
    + kan ha många olika antikroppar med samma fc-region så man kan använda samma detektionsreagens mot alla.
42
Q

Vad är genetiska fusioner?

A

Genetiska fusioner kan ske med fluorescenta proteiner som mCherry eller GFP. Ex. sätter man genen för fluorescenta proteinet efter heavy chain. Sedan uttrycks fusionsproteinet, alltså heavy chain med GFP. Två tunga kedjor ger två GFP.

43
Q

Hur märker man in med radionuklider?

A

Det är oftast makrocykliska kelatorer som används. Kelatorn med sin ringstruktur fäster kovalent till antikroppen. Märker in på ex. cystein eller lysin. Sedan märker man in med radionukliden vilken binder binder (icke-kovalent) till kelatorn.