Fixação Flashcards
Para que serve?
Etapa fundamental que serve para preservar os tecidos
Principios Gerais: Imobilização de células e tecidos
A partir do momento em que o tecido é retirado, a autólise das células deixa de ser evitada e as enzimas começam a digerir as membranas proteicas.
Assim queremos que a fixação promova a máxima semelhança entre o tecido visto ao MO e in vivo
Principios Gerais: Inibição da Autólise Celular
Começa a haver uma autodigestão enzimática; Leva a instabilidade da membrana lisossómica e à rutura das membranas. Isto provoca uma libertação enzimática e assim à destruição.
O grau de autólise depende do órgão e do seu conteudo enzimático.
Efeitos ao MO –> áreas de necrose
Principios Gerais: Inibição da putrefação tecidular
É a destruição dos tecidos por ação microbiana, através de toxinas e enzimas bacterianas.
Orgãos com flora normal abundante são os mais sujeitos (intestino, estômago, vesícula)
Efeitos ao MO –> coloração difusa, vacuolização
Principios Gerais: Solidificação do material coloidal
Fixação induz a formação de novas ligações o que leva à solidificação.
Quistos ficam transformados em geis e não solidificam.
Principios Gerais: Endurecimento
É desejável e permite a manipulação das peças sem as danificar
Principios Gerais: Modificação dos indices de refração
Fixação muda o indice de refração de forma não uniforme e por isso permite distinguir certos detalhes celulares mesmo antes da coloração
Principios Gerais: Modificação do Volume
Varia consoante a quantidade de água que constitui o tecido e a PO entre fixador e tecido.
É de evitar que haja distorção do tecido.
Principios Gerais: Insolubilização dos constituintes celulares
As substancias devem ser insoluveis no fixador para que não se percam.
Há fixadores específicos para cada tipo de substancias. Por exemplo: Fixadores alcoolicos preservam melhor o glicogénio do que qualquer outro.
Principios Gerais: Modificação de afinidades tinturiais
A fixação pode ter um efeito:
Positivo - separa ácidos nucleios das histonas e permite a sua deteção e estudo
Negativo - fixação longa extrai os ácidos nucleicos e anula o seus estudo. Há basofilia nuclear.
Métodos de Fixação Físicos: Frio
A congelação do tecido é a forma de fixação e conservação.
Métodos:
Congelação instantânea por imersão em isopentano
Criodissecação ou Liofilização (uso de nitrogénio líquido; conserva estrutura antigénica)
Criosubstituição: rápida; tecidos imersos em acetona e etanol
Cortes de Congelação
Usados para: Estudos de lípidos Estudos histoenzimáticos Estudos de imunoflorescencia (deteção de antigénio) Exames Temporâneos
Métodos de Fixação Físicos: Calor
Faz alterações profundas nos tecidos, maioritariamente irreversíveis;
Usa-se quando se querem acelerar as reações
É usado o microondas
Serve apenas para biópsias pequenas; é necessária a utilização de solução de NaCl a 0,9%; há preservação de antigénios
Métodos de Fixação Químicos: Vapores
Aquece-se o fixador e coloca-se o tecido a fixar por cima deste. Libertam-se vapores que levam à fixação.
Usado em:
Tecidos preservados por criodissecação; imunocitoquímica; estudos de flurescencia; demosntração de enzimas hidrolíticas; estudos ultraestruturais em ME
Quais os fixadores usados para estudos ultraestruturais na ME?
Formaldeído, Glutaraldeído; Tetróxido de ósmio;
Métodos de Fixação Químicos: Perfusão
Injeta-se reagente fixador no sistema circulatório e permite um estudo in vivo (só usado na experimentação)
Usa-se em AP pseudo-perfusão que é usada para estudo da árvore bronquica. É uma técnica ex vivo
Métodos de Fixação Químicos: Imersão
Contacto direto do fixador com o tecido;
A fixação ocorre de fora para dentro
É o método mais utilizado
Fatores que influenciam a fixação por imersão
Intervalo entre a colheita e a fixação deve ser o mais curto possível Rapidez Volume do fixador Espessura do material biológico Consistencia dos tecidos Tempo de fixaçao Concentração do fixador Temperatura pH Lavagens pós-fixação PO Tipo de fixador
Situações especiais de fixação de órgãos:
Pulmão - pulmão está cheio de ar e por isso flutua. Faz-se pseudo-perfusão pela árvore bronquica e coloca-se gazes embebidas em formalina na superficie do pulmão para este ficar totalmente submerso.
Mama - tem tecido adiposo e por isso tendencia a flutuar e é um tecido dificil para o fixador penetrar. Fazem-se cortes seriados paralelos para aumentar a superficie de contacto. Coloca-se gaze embebida entre os cortes e em cima
Intestino e estomago - colocar gaze no lumen de forma a não enrolar ou então estica-se numa placa.
Rapidez de penetração do fixador
Dependo do tipo de agente quimico;
É uma propriedade intrinseca de cada fixador.
Ordem (+rápido 1º) - ácido acético; acido tricloroacetico; formalina 10%; etanol 95%; cloreto de mercurio; Ácido pícrico; bicromato de potássio; tetróxido de ósmio.
Volume do fixador
Influencia diretamente a rapidez;
Volume deve ser suficiente para deixar a peça totalmente submersa
Espessura do material
Quanto menor a espessura mais rápida e eficiente é a fixação;
Espessura máxima - 5mm
Consistencia dos tecidos
Mais denso, mais dificil a penetração
Duração da fixação
Varia consoante: Espessura das peças Volume das peças Volume de fixador Temperatura Tipo de fixador (há fixadores que atuam de forma mais rápida e outros de forma mais lenta)
Concentração do Fixador
Quanto mais concentrado mais rápida vai ser a fixação
concentrações elevadas podem ser prejudiciais
Temperatura
Maior temperatura acelera
Menor temperatura retarda a fixação
pH
Fixadores normais - pH entre 6 e 8
Para preservação de ultraestruturas usam-se soluções tampão com pH entre 7.2 e 7.4
Lavagem após fixação
Serve para remover os pigmentos artefatuais que as vezes se formam.
Pigmento formólico causado pela acidificação da formalina devido à formação de ácido fórmico tem uma cor castanha. Remove-se com Acido picrico alcoolico ou carbonato de litio
Pigmento de ácido picrico - tem cor amarela fluorescente e é removido com carbonato de litio
Pigmento de mercurio - removido com iodina de Lugol ou Tiossulfato de sódio.
Pressão Osmótica
Soluções hipotónicas - água entra e pode provocar o rebentamento das células
Soluções hipertónicas - água sai e tecido retrai
Tipos de Fixadores (Modo de Atuação)
Aditivos - adicionam grupos metileno e ligações cruzadas; provocam alteração no tecido
Não aditivos
Coagulantes - precipitam proteínas devido a uma rápida penetração
Não coagulantes - forma-se um gel e os tecidos ficam mais impermeáveis.
Classificação segundo o modo de atuação:
Etanol; Acetona; ácido pícrico; formalina; glutaraldeído; Metanol
Etanol - não aditivo coagulante Acetona - não aditivo coagulante ácido pícrico - aditivo coagulante formalina - aditivo não coagulante glutaraldeído - aditivo não coagulante metanol - não aditivo coagulante
Tipo de fixador (Mecanismo de ação)
álcoois - fixadores por coagulação
aldeídos - fixadores aditivos que adicionam ligações cruzadas e fazem preservação antigénica
Agentes oxidantes - aditivos e desnaturação proteica (coagulantes)
Mercúrios
Picratos - ácido picrico e líquido de bouin
Tipo de fixador (Natureza das estruturas a fixar) - Ácidos nucleicos
Fixadores Ideais - ácido acético e solução de Carnoy
Mais utilizado - formalina
Há estabilização das proteínas nucleares
Tipo de fixador (Natureza das estruturas a fixar) - Lípidos
Fixador ideal - formalina tamponada 10%; tetróxido de ósmio e ácido de crómio
Tipo de fixador (Natureza das estruturas a fixar) - Glícidos
Glicogénio e glucose têm tendencia a desaparecer.
Fixador ideal - Carnoy’s, Gendre’s, formalina alcoolica ácida, álcool absoluto, metacarn
Tipo de fixador (Natureza das estruturas a fixar) - Proteínas
Fixadores aditivos alteram a estrutura terciária
Fixadores não aditivos coagulantes tornam a proteína terciária insoluvel
fixador ideal - Clark-Carnoy; Carnoy; Metacarn
Metanol e etanol são fixadores ideais para estruturas terciárias, mas não para secundárias
Fixadores: Formaldeído ou Metanal
É fixador aditivo não coagulante
Fixador universal.
O paraformaldeído quando aquecido a 60ºC gera o gás que é o formaldeído. Este em solução aquosa forma a formalina.
A formalina tem uma concentração entre 37%-40%. Numa solução de 10% tem entre 3,7 a 4% de formaldeído.
Caracteristicas - penetra rapidamente e de forma uniforme; endurece moderadamente; pouca retração; fixador lento; preserva tecido adiposo (lípidos); tempo máximo de fixação indeterminado
Desvantagens: é lento; carcinogénico; tóxico quando ingerido; irritante
Fixadores: Líquido de Bouin
É composto = ácido pícrico + ácido acético + formalina a 37%-40%
Indicado para exames histoquímicos
Utilizado para visualização de gânglios
Coloração amarela possível de ser removida com etanol ou etanol 70% saturado com carbonarto de lítio
Fixador rápido
Tempode fixação máximo = 8 dias
Fixadores: Etanol
Fixador não aditivo coagulante
Utilizado para preservação de componentes de tecidos soluveis em água como o glicogénio
Dissolve lípidos
Torna o fragmento duro e quebradiço
Faz desaparecer grânulos e pigmentos acidófilos.
Características de um bom fixador:
Penetração rápida e uniforme (homogénea)
Não provoca retração
Evidencia estruturas intracelulares
Evita o desaparecimento de formações solúveis
Confere solidez e insolubilidade suficientes
Não cria artefactos
