F21+F22: DNA-replikation, mutationer og DNA-repair Flashcards
Redegøre for DNA polymerasens funktion
Syntese:
Syntese af DNA ud fra DNA-template i 5’-3’-retningen i S-fasen. Syntese af kontinuerlig streng efter leading strand og af okazakifragmenter efter lagging strand. Sætter op mod 1000 nukleotider på pr. sekund ud fra primer (50/s i eukaryoter). Der sker fraspaltning af pyrophosphat.
Proofreading:
Proofreading inden hvert nukleotid påsættes gennem affinitetsafhængig mekanisme og gennem konformationsændring katalyseret af korrekt nukleotid.
Editing:
Hvis forkert nukleotid sættes på, er 3’-OH ikke placeret korrekt, og strengen flyttes til editingsite, hvor DNA-polymerasens 3’-to-5’-exonuklease-site fjerner nukleotider.
Redegøre for replikationsmekanismen
Bidirektionel syntese med udgangspunkt i de mange origins. Syntesen katalyseres af DNA-pol. Sliding clamps loadet af clamploader holder DNA-pol. på strengen men lader den dissociere ved møde med dobbeltstreng. Før DNA-pol. kan komme til, skal DNA åbnes. Der sker vha. DNA-helicase, der “lyner” strengen op. SSB-proteiner stabiliserer single strand men lader baser være synlige og forhindrer hairpins. Syntesen sker altid i 5’3’-retningen, og kan ske kontinuerligt på leading strand. På lagging strand dannes i stedet Okazaki-fragementer af DNA-pol. initieret af RNA-primer påsat af DNA-primase. Denne RNA-primer fjernes senere hen med reparationsmekanisme, og den erstattes af DNA. Herefter forsegler DNA-ligase.
DNA-pol. har en proofreading-funktion, der muliggør tjek af påsatte nukleotider. Ved fejl virker 3’5’-proofreading exonuclease –> nyt nukleotid kan påsættes.
Lagging strand danner loop, hvor clamploader og RNA-primase sidder fast. Kompleksdannelse.
Hvorfor bruges RNA-primer?
Der bruges RNA-primer for at kunne starte de novo, men det behøver ikke være helt korrekt, og det er let at genkende og erstatte.
Forklare funktion af telomerase og biologisk betydning af telomere
Den sidste RNA-primer, der skulle have været brugt til syntese af det sidste Okazaki-fragment kan ikke blive erstattet af DNA, da der ikke er nogen 3’-OH-ende tilgængelig for polymerasen. For at forhindre at DNA bliver kortere ved hver replikation, har eukaryoter telomerer. De indeholder mange repeats af GGGTTA, der genkendes af telomerase. Telomerase forlænger telomerer 5’-3’ med udgangspunkt i enzymets egen RNA-template (i stil med revers transkriptase). Herefter kan der ske replikation af lagging strand på vanlig vis.
Biologisk betydning: Telomerforkortelse forhindrer ubegrænset proliferation ved at give naledning til senescens. Stamceller har telomeraseaktivitet og bliver derfor ved med at kunne dele sig. Fejl i telomeraseaktivitet kan give ustabilt genom og føre til cancer.
Forklare hvordan mutationer kan opstå
Mutationer kan opstå pga. fejl i DNA-polymerasereaktionen, der kan skyldes tautomerisering eller ændring af helixgeometri¨
Fejl i 3’-to-5’ proofreading exonuklease.
Spontane mutationer kan opstå pga. varme, stråling og kemikalier.
Forklare proofreading og mis-match repair mekanisme og deres biologiske betydning
DNA-polymerasens proofreadingmekanisme sker gennem høj affinitet for det korrekte nukleotid, hvorfor ukorrekte vil diffundere bort. Tilsvarende katalyseres enzymets konformationsændring oftere af korrekt nukleotid.
Exonukleolytisk proofreading: 3’-to-5’ proofreading exonuklease klipper forkert base ud. Er en del af DNA-pol.
Stranddirected mismatchrepair: Baseret på forvrængning af strengen, når baser er mismatchede. I coli er det baseret på methylerede A’er, mens det i eukaryoter er baseret på nicks.
Der sker gennem tre trin: 1. genkendelse 2. fjernelse af forkerte segment (hen til nicks) 3. inkoporation af rigtigt segment
Det mindsker mængden af mutationer
Forklare excision repair som et eksempel på DNA reparation
Base-excision repair bruges hvis der er fejl i en base. Først virker en glykosylase til at skære basen ud (fx deamineret C –>U). Basen dissocierer, og en AP-endonuklease og en phosphodiesterase virker til at skære sukkerphosphatdelen fri, så DNA-pol. kan påsætte rigtigt nukleotid, og DNA-ligase forsegler.
Nukleotid excision repair reparerer større skader (der giver bulky struktur), fx dimerer ved først at fjerne det område, hvor fejlen er vha. excision nuklease og derefter helicaseaktivitet efterfulgt af DNA-pol. og DNA-ligase.
Forklare den biologiske betydning af homolog og non-homolog rekombination
Bruges begge ved dobbeltstrengsbrud forårsaget af fx stråling, replikationsfejl og oxidering.
Nonhomolog rekombination ses oftest i somatiske celler og er “quick and dirty”, hvor de to ender sættes sammen via bl.a. Ku-protein, fordi en lille del af vores genom er essentielt. Det tjekkes dog ikke, om de to ender er fra samme kromosom, hvilket kan give probblemer med centromerer, telomerer og kromosomadskillelse.
Homolog rekombination bruges i S og G2, hvor der er søsterkromatider, som kan udveksle information på (næsten) identiske DNA-strenge. På den måde kan større DNA-skader udbedres, fx dobbeltstrengsbrud eller forfejlet replikationsgaffel. Mekanismen bruges til overkrydsning under meiosen. Der er dog risiko for fejl, fx at bruge homologt kromosom i stedet for søsterkromatid, så heterozygositet tabes, hvilket kan give cancer. Derfor sker det før homologe kromosomer alignes. Brca1+2 regulerer homolog rekombination.
Hvad er årsagen til at der ikke sker syntese i 3’-5’-retningen?
Det er ikke mulig at rette fejl, fordi den voksende 5’-streng skal have de aktiverende P-grupper. Hvis der sker fejl, som skal rettes ved at fjerne basen, er energien brugt, og der er kun en OH-gruppe tilbage.
Beskriv, hvordan helicasen virker
Hydrolyse af ATP gør at den kan propellere hen ad enkeltstreng og derved lyne dobbeltstreng op. Der findes helicasser for begge retninger (5’-3’ og 3’-5’)
Beskriv, hvordan helicasen virker
Hydrolyse af ATP gør at den kan propellere hen ad enkeltstreng og derved lyne dobbeltstreng op. Der findes helicasser for begge retninger (5’-3’ og 3’-5’)
Hvad kræver DNA-pol?
dNTP, salte og primer med -OH
Hvordan sker koordinering af replikation med cellecyklus?
I G1 sidder ORC (origin recognition complex) på origin of replication. Helicase påsættes. Ved S-Cdk aktiveres helicase og replikationsmaskineriet rekrutteres. ORC er phosphoryleret og kan derfor ikke aktivere igen før næste cyklus.
Hvad er nicks?
Huller i DNA på lagging strand inden DNA-ligase ligerer. Der er også nicks i leading strang, så straand directed mismatch repair kan finde sted, men man ved ikke hvordan det sker.
Hvad er nicks?
Huller i DNA på lagging strand inden DNA-ligase ligerer. Der er også nicks i leading strang, så straand directed mismatch repair kan finde sted, men man ved ikke hvordan det sker.
Hvad er funktionen af topoisomeraser, og hvad gør hhv. I og II?
I stedet for at DNA skal snurre hurtigt rundt (energetisk ufavorabelt) dannes overwound loops.
Topoisomeraser kan kovalent binde til backbone ved at bryde fosfodiesterbindingen. Processen er reversibel og kræver ikke ATP.
I: Bryder 1 streng og tillader rotation, så dobbeltstrengen kan blive viklet ud
II: Bryder to strenge, hvilket er aktuelt, når to dobbelthelices krydser ind over hinanden. Bruger ATP til reaktionen: 1: Dobbeltstrengsbrud (2 ATP) 2: Før streng igennem for at mindske supercoiling 3: Forsegling
