Exercices - étapes détaillées d'un clonage moléculaire Flashcards
Quelles sont les principales étapes d’un clonage moléculaire?
Élaboration d'une stratégie Digestion vecteur + insert Purification vecteur + insert Déphosphorylation vecteur Ligation de l'insert avec le vecteur Transformation bactérienne avec produit de transformation Sélection et/ou criblage des transformants Entreposage des transformants
Quelles sont les considérations pour le choix du vecteur et de l’insert?
Le besoin ou non... D'une étiquette D'un promoteur particulier De caractéristiques particulières D'un simple vecteur avec les composantes régulières
Comment peut-on détruire des sites de restriction?
En utilisant des enzymes de restriction qui vont digérer un fragment.
Quelles sont les principales stratégies pour le choix des sites de restriction lors d’un clonage?
Sites de restriction cohésifs entre eux
Sites différents de chaque côté du vecteur et de l’insert
Site unique dans le vecteur et dans l’insert
Enzymes couramment utilisées
Vérifier la compatibilité de réaction entre les enzymes
Que doit-on faire s’il n’est pas possible de trouver des sites cohésifs entre notre vecteur et notre insert?
Il faut utiliser des enzymes qui produisent des extrémités à bouts francs.
Pourquoi doit-on déphosphoryler le vecteur plutôt que l’insert?
Parce que la déphosphorylation de l’insert n’empêcherait pas le vecteur de se refermer sur lui-même, ce qui est le but de la déphosphorylation.
Quelles sont les conditions d’une digestion enzymatique normale?
Une heure à 37 degrés Celsius.
Comment le vecteur et l’insert sont-ils purifiés après la digestion?
Ils pourront être déposés sur un gel d’agarose. Les bandes d’intérêts pourront être découpées et extraites à l’aide de kits commerciaux variés (dont QIAGEN)
À quel moment le vecteur peut-il être déphosphorylé?
Habituellement, la déphosphorylation se fait après la purification sur gel du vecteur digéré.
Qu’est-ce que la compatibilité des tampons pour la digestion?
C’est le fait que chaque enzyme possède ses conditions de réactions optimales, dont un tampon fourni par le fabriquant. Le tampon diffère d’une enzyme à l’autre, donc faire attention et utiliser le tampon fourni par le fabricant ou cela peut ne pas fonctionner.
Expliquez pourquoi la ligation n’est pas réalisée à 37 degrés Celsius?
Parce que la ligase est une enzyme thermosensible.
Comment un contrôle peut-il nous permettre de vérifier que la digestion du vecteur est complète?
En utilisant un vecteur digéré, sans ligase et sans l’insert, pour effectuer la transformation. Théoriquement, on ne devrait pas obtenir de transformants puisque les vecteurs sont linéarisés.
Comment un contrôle peut-il nous permettre de vérifier que la déphosphorylation a été efficace?
Un vecteur digéré, avec la ligase et sans l’insert ne devrait pas être recircularisé si la déphosphorylation est efficace.
Comment un contrôle peut-il nous permettre de vérifier que la transformation a été efficace?
En réalisant une transformation supplémentaire avec une quantité établie de plasmide circulaire connu pour être capable de transformer la bactérie et de former des colonies sur milieu sélectif.
Criblage :
Permet de distinguer les clones ayant intégré l’insert d’intérêt versus ceux qui ne l’ont pas intégré, grâce à la couleur notamment.
